灯盏花素含药血清对谷氨酸致原代海马神经元损伤的影响

目的:从细胞水平研究注射用灯盏花素对谷氨酸致大鼠原代海马神经元损伤的保护作用及其作用机制。方法:采用中药血清药理学方法,制备含药血清;原代培养大鼠乳鼠大脑海马神经元并经鉴定后,以谷氨酸复制损伤模型,以5%含药血清干预,在透射电镜下及经碘化丙啶和Hoechst33342双染后荧光显微镜下观察海马凋亡神经元的形态学变化,并进行检测:MTT法测定细胞存活率,生化法检测LDH漏出率、丙二醛(MDA)含量、细胞释放的NO量、细胞内tNOS活性和iNOS活性。结果:灯盏花素高、低剂量组均能明显增加海马神经元存活率,而LDH漏出率、丙二醛(MDA)含量、一氧化氮释放、总一氧化氮合酶活性和诱导型一氧化氮合酶活性(p<0.05,p<0.01)明显降低。结论:灯盏花素对谷氨酸致原代培养大鼠海马神经元损伤具有保护作用,其作用机制可能与其能改善能量代谢、稳定细胞膜、抗脂质过氧化、降低一氧化氮合酶的活性、减少一氧化氮释放有关。     

大鼠海马神经元体外缺糖缺氧模型的建立

目的：建立体外培养大鼠海马神经元缺糖缺氧模型。方法：取培养12d的海马神经元,在缺糖缺氧条件下分别培养0．5～4h后取出,换原神经元培养液,在常氧下继续培养24h后测定培养液中乳酸脱氢酶活性。测定神经元形态变化,并计算神经元存活百分率。同时用原位末端标记(TUNEL)法检测神经元凋亡。结果：缺糖缺氧后海马神经元胞体逐渐肿胀,培养液中LDH释放量逐渐增多,细胞存活率逐渐减少。恢复糖和氧供应后24h,凋亡神经元百分率明显增多。结论：用改进的无血清、无糖人工脑脊液成功建立了大鼠海马神经元离体缺糖缺氧模型。     

益智仁对谷氨酸损伤的大鼠离体培养皮层神经元的保护作用研究

目的:通过观察单味中药(益智仁)对离体培养的大鼠皮层神经元谷氨酸损伤模型的保护作用,探讨中药益智仁益智作用的机理,以初步论证中药益智仁对人体的益智效果.方法:利用原代离体培养的大鼠皮层神经元,分为6组:空白对照组,损伤模型组,阳性对照组,益智仁高剂量组,益智仁中剂量组,益智仁低剂量组,制备离体培养皮层神经元的谷氨酸损伤模型,采用MTT法测定细胞存活率,并测定LDH漏出率.结果:MTT法检测结果显示,与空白对照组相比,损伤模型组皮层神经元OD值显著降低(P＜0.05);与损伤模型组相比,各治疗组皮层神经元OD值显著升高(P＜0.05).LDH漏出率检测结果显示,与空白对照组相比,损伤模型组皮层神经元LDH漏出率显著升高(P＜o.05);与损伤模型组相比,益智仁中、高剂量组皮层神经元LDH漏出率显著降低(P＜0.05);其他组皮层神经元与损伤模型组相比,LDH漏出率无显著性差异(P＞0.05).结论:益智仁能够有效的降低细胞的死亡,提示其对线粒体功能具有保护作用,并对初期和后期损伤细胞均有保护作用,但具体作用靶点还需后续实验进一步研究.     

ELK-1/JNK/c-Fos对左归降糖解郁方(ZGJTJYF)体外培养的模拟糖尿病并发抑郁症(DD)大鼠海马神经元凋亡中的作用

目的:研究信号通路ELK-1/JNK/c-Fos在左归降糖解郁方(ZGJTJYF)对模拟糖尿病并发抑郁症(DD)环境下抗海马神经元凋亡中的作用。方法:原代培养海马神经元,加入高糖(150 mmol/L)+皮质酮(200μmol/L),构建DD体外细胞模型;将培养的海马神经元细胞随机分为5组:空白血清组、正常组、左归降糖解郁方含药血清组、阳性药(二甲双胍+氟西汀)含药血清组和模型组(每组3个复孔)。模型组和正常组给予等量培养液,其余组加入相应体积分数10%的相应血清,均干预18 h。分别采用Hoechst染色、高内涵细胞成像分析技术和RT-PCR技术分别检测海马神经元凋亡情况及检测凋亡相关ELK-1、JNK和c-Fos蛋白和基因的表达。结果:与空白组比较,模型组细胞凋亡明显,其海马神经元凋亡数量明显增多,ELK-1、JNK和c-Fos的mRNA及蛋白表达水平均显著升高(P<0.05);与模型组比较,左归降糖解郁方含药血清组和阳性药含药血清组大鼠海马神经元可见局部亮点明显减少,凋亡细胞数显著减少,ELK-1、JNK和c-Fos蛋白及mRNA表达均明显下调(P<0.05),且神经网络及树突连接情况得到明显改善。结论:左归降糖解郁方可以减低DD环境下海马神经元中Elk-1、JNK、c-fos表达而起到抗凋亡的效果。     

姜黄素对自发性高血压大鼠海马缺血/再灌注损伤神经元凋亡核通路的影响

目的:探讨自发性高血压大鼠(SHR)脑缺血/再灌注损伤海马神经元凋亡c-Jun氨基末端激酶(JNK)核通路的变化特点,以及姜黄素对其保护作用可能机制。方法:雄性Wistar-Kyoto大鼠(WKY)和SHR,随机分为5组:WKY假手术组(W-Sham组)、缺血/再灌注组(W-I/R组)和SHR假手术组(S-Sham组)、缺血/再灌注组(S-I/R组)、姜黄素100mg/kg预处理组(S-Cur组),上述5个实验组按再灌注时间又分为再灌注2h、6h、1d、3d、7d5个亚组(n=6)。采用四动脉结扎法制备脑缺血/再灌注模型,以TUNEL法检测海马CA1区的细胞凋亡,免疫组化法分析海马CA1区c-jun、c-fos的动态变化。结果:S-Sham组大鼠海马CA1区TUNEL细胞数量和c-jun、c-fos表达高于W-Sham组(P0.05),S-I/R组TUNEL细胞数量和c-jun、c-fos表达高于S-Sham组及W-I/R组(P0.05);S-Cur组TUNEL细胞数量和c-jun、c-fos表达较S-I/R组明显降低(P0.05)。结论:缺血/再灌注更易导致SHR海马神经元凋亡。姜黄素可抑制SHR脑缺血/再灌注损伤海马神经元凋亡,其作用机制可能与抑制c-jun、c-fos蛋白的表达有关。     

线粒体大麻素受体1在大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中对线粒体分裂的影响

目的:探讨线粒体CB1受体(mitochondrial cannabinoid receptor1,mtCB1)在大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中对线粒体分裂的影响。方法:原代培养新生的Wistar大鼠海马神经元,将培养至第8天的海马神经元采用随机数字表分为5组(n=60):正常组(N组):正常培养,不做任何处理;缺氧复氧组(H/R组):采用氧糖剥夺法构建海马神经元缺氧复氧损伤模型,缺氧6h,复氧20 h;缺氧复氧组+ACEA+AM251组(H/R+ACEA+AM251组):缺氧6 h结束后立即加入ACEA和AM251,终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L,复氧20 h;缺氧复氧+ACEA+Hemopressin(H/R+ACEA+Hemo组):缺氧6h结束后立即加入ACEA和Hemopressin,终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L,复氧20 h;缺氧复氧+赋形剂组(H/R+V组):同样于缺氧6h结束后立即加入二甲基亚砜(DMSO),终浓度0.1%,复氧20 h。使用激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca~(2+)的浓度,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测凋亡诱导因子(AIF)、线粒体分裂相关蛋白Drp1、Fis1,细胞凋亡相关蛋白细胞色素C(Cytc)和Rho相关的卷曲蛋白激酶1(ROCK1)的表达。结果:与N组相比,H/R组、H/R+ACEA+AM251组、H/R+ACEA+Hemo组和H/R+V组的细胞内Ca~(2+)浓度、细胞凋亡率、以及AIF、Drp1、Fis1、Cytc、ROCK1蛋白的表达水平均明显增加(P0.05);与H/R组相比,H/R+ACEA+Hem组上述各检测指标明显降低(P0.05),H/R+ACEA+AM251组和H/R+V组各指标比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:线粒体CB1受体(mtCB1受体)可能通过降低细胞内ROS的含量来减少细胞内Ca~(2+)浓度和ROCK1的表达,进而抑制线粒体分裂,并最终减轻海马神经元缺氧复氧损伤。     

肝细胞生长因子对氧糖剥夺/再灌注神经元的保护作用

本文旨在探讨肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）对神经元氧糖剥夺/再灌注损伤的影响。取原代培养12d的Sprague-Dawley大鼠大脑皮层神经元,无糖、无氧（95%N2＋5%CO2）孵育2h后,换含25mmol/L葡萄糖的培养液、常氧培养0-24h,以MTT比色法检测细胞活力、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）漏出率作为细胞损伤指标,建立体外氧糖剥夺/再灌注损伤细胞模型;用流式细胞仪和Hoechst33258染色分析细胞凋亡率;用RT-PCR和Western blot分别检测大鼠脑皮层神经元HGF受体c-Met mRNA和蛋白的表达。于氧糖剥夺2h/再灌注24h处理前2h,加入不同终浓度（5-120ng/mL）的HGF,观察HGF对皮层神经元的影响。结果显示,c-Met表达于皮层神经元,氧糖剥夺2h/再灌注24h后,c-Met mRNA和蛋白表达均显著上调,神经元细胞活力明显降低,LDH漏出率和细胞凋亡率显著增高。HGF预处理明显促进氧糖剥夺/再灌注损伤神经元的存活,降低LDH漏出率,最大效应剂量为80ng/mL。流式细胞术和Hoechst33258染色结果均显示,HGF（80ng/mL）显著降低氧糖剥夺/再灌注神经元的细胞凋亡率。此外,c-Met抑制剂SU11274（5μmol/L）完全阻断HGF的神经保护作用。结果表明,HGF对皮层神经元氧糖剥夺/再灌注损伤具有直接的保护作用,呈一定的剂量依赖关系,并能有效对抗神经元凋亡。     

抑郁症大鼠海马神经元凋亡率和自噬相关蛋白的改变

目的 观察抑郁症模型大鼠海马神经元形态结构改变及凋亡、自噬的变化,探讨抑郁症海马体积异常的机制.方法 选用雄性成年SD大鼠,随机分为正常对照组和模型组,通过给予不可预见慢性温和应激建立抑郁症模型;采用尼氏染色、透射电镜技术观察海马神经元形态变化,流式细胞术检测海马神经元凋亡,采用透射电镜观察海马神经元自噬体,Western blott检测自噬相关蛋白LC-3和Beclin 1.结果 与对照组比较,模型组海马神经元体积萎缩,数量减少,细胞凋亡率增高（P〈0.05）.模型组海马神经元胞质内可见自噬体;与对照组相比,模型组LC-3Ⅱ蛋白和LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ比值增高,Beclin-1相对表达增高（P〈0.05）.结论 抑郁症大鼠海马神经元存在体积萎缩现象,可能与神经元凋亡和自噬增强有关.     

二氮嗪预处理上调Bcl-2/Bax蛋白比值减少缺氧复氧所致体外培养的海马神经元凋亡

线粒体内膜ATP敏感钾通道（mitochondrial ATP-sensitive potassium channel,mitoKATP通道）的激活在药物预处理增强神经元对各种损伤的耐受力过程中发挥着重要作用。神经元内含有丰富的mito KATP,通道,二氮嗪（diazoxide,DZ）为选择性的mitoKATP通道开放剂,本实验探讨了DZ预处理能否减少缺氧复氧所致的海马神经元凋亡,以及DZ如何调控Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表达。原代培养9～10d的Sprague-Dawley大鼠海马神经元随机分为5组：对照组、DZ0μmol／L、DZ30μmol／L、DZ100μmol／L和DZ100μmol／L＋5-羟癸酸（5-hydroxydecanoate,5-HD）100μmol／L。除对照组外,其他四组神经元白缺氧前3d开始,每天DZ预处理1h,连续3d。体外缺氧4h,于复氧后24h,四唑蓝比色法测定海马神经元存活率,annexin V-FITC流式细胞术测定凋亡率,Western blot法检测Bcl-2和Bax蛋白的表达量。结果显示：与对照组比较,缺氧复氧损伤显著降低海码神经元的存活率,升高凋亡率。与其他浓度比较,100μmol／LDZ预处理使神经元存活率升高约15％,而凋亡率降低约12％：Bcl-2蛋白表达增强约60％,Bax蛋白表达下降近30％。5-HD消除DZ对神经元的保护作用。因此,100μmol／LDZ可通过上调Bcl-2蛋白表达,降低Bax蛋白表达,减少缺氧复氧后海马神经元的凋亡。     

PSD-95结构域PDZ1过表达拮抗缺氧缺糖诱导的海马神经元凋亡

为了观察突触后致密物质-95（postsynaptic density95,PSD-95）结构域PDZI过表达对缺氧缺糖诱导的海马神经元凋亡的影响,本研究采用培养21d的Sprague—Dawley大鼠海马神经元,加入PDZ2腺病毒颗粒感染24h,收集细胞进行免疫沉淀、免疫印迹实验;缺氧缺糖1．5h后,用DAPI染色后荧光显微镜观察细胞凋亡,并收集细胞进行免疫印迹实验。结果显示：（1）PDZ2在海马神经元中过表达;（2）过表达的PDZ1使缺氧缺糖诱导的海马神经元凋亡数量减少（P〈0．05）;（3）过表达的PDZ1使PSD-95与GluR6结合减少;（4）PDZ1过表达抑制由缺氧缺糖诱导的火鼠海马神经元MLK3和JNK1／2磷酸化。以上结果提示,PDZ1过表达能拈抗缺氧缺糖诱导的海马神经元凋亡。