一个体外构建的重组质粒——pCBI

构建了质粒pBR322和pCRI 的重组质粒——pCBI。已通过转化技术将其送入大肠杆菌,在含有四环素和卡那霉素的培养基中筛选了转化子。在细菌培养液内加入氯霉素使转化子中的重组质粒扩增。采用琼脂糖凝胶电泳法及水溶性两相抽提法纯化重组质粒。重组质粒pCBI 的电泳速度低于两个亲本质粒。用限制酶EcoRI 降解重组质粒,在凝胶电泳上看到两条带,它们的位置分别对应于pBR322线性DNA和pCRI 线性DNA。电镜观察到环状pCBI DNA 并测得其长度为5.77±0.30微米,折合分子量为(11.9±0.6)×10~6道尔顿。     

高粱基因组DNA提取方法的比较与优化

目的：比较CTAB法和高盐低pH法提取高粱总DNA效果,进一步优化建立高盐低pH值法提取高粱基因组DNA的方法。方法：采用CTAB法、高盐低pH法对高粱叶片DNA进行提取,并从电泳结果、纯度、得率三方面进行比较研究。通过提取缓冲液中SDS浓度的优化,不同组织器官的DNA提取纯化以及不同沉淀方法的优化,比较不同方法对高粱基因组DNA提取的影响。结果：高盐低pH法DNA平均得率为689.36μg/g,略小于CTAB法的718.26μg/g,但其A260/A230平均值为1.854,比CTAB法的2.164更接近标准要求。高盐低pH法提取高粱基因组DNA的适宜条件确定如下：提取液中含有2%SDS、2%PVP、2%β-巯基乙醇;水浴时间30min;沉淀方法采用0.7体积异丙醇室温沉淀的沉淀方法。结论：综合考虑高盐低pH法是提取高粱基因组DNA的最佳方法。     

类核沉降法对三个着色性干皮病(XP)家系成员DNA修复能力的测定及杂合子的检出

应用类核沉降法,分析了三个着色性干皮病家系中35名成员外周血淋巴细胞在紫外线(2.5μJ/mm~2)照射和MNNG(2μg/mI)损伤后DNA修复能力。结果表明,6名XP患者和9名杂合子DNA损伤后20小时尚不能完成修复,他们11小时DNA修复率均值分别为UV,0.61±0.13,0.59±0.15和MNNG,0.44±0.15,0.46±0.16,与家系中10名非血缘亲属正常人DNA修复率均值为UV,0.96±0.07,MNNG,0.71±0.07相比,差异非常显著(Ρ<0.01),而XP患者和杂合子DNA修复率则无显著性差异(Γ>0.05)。提示,类核沉降技术可能为XP家系中杂合子成员检出提供一种有希望的方法。     

细胞外pH值降低可增强豚鼠心室肌细胞持续性钠电流

应用全细胞和单通道(贴附式)膜片钳技术观察胞外pH值降低对心室肌细胞持续性钠电流(persistent sodium current,ⅠNa.P)的影响,探讨其作用机制。结果显示:全细胞记录模式下,细胞外pH值降低可明显增大ⅠNa.P,且呈H+浓度依赖性增强。当细胞外pH值从对照值的7．4降低为6．5时,ⅠNa.P的电流密度从(0．347±0．067)pAJpF增加到(0．817±0．137)pA/pF(P< 0．01,n=6),而加入还原剂1,4-二硫甙苏糖醇(dithiothreitiol,DTT,1 mmol／L)后可使,ⅠNa.P的电流密度回落到(0．233±0．078)pA／pF (P<0．01 vs pH 6．5,n=6)。单通道记录模式中,当细胞外pH值从对照值的7．4降低为6．5时,持续性钠通道的开放概率和开放时间分别从0．021±0．007和(0．899±0．074)ms增加到0．205±0．023和(1．593±0．158)ms(P<0．叭,n=6),再加入还原剂DTT(1 mmol／L)使开放概率和开放时间分别回落到0．019±0．005和(0．868±0．190)ms(P<0．01 vs pH 6．5,n=6);加入蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制剂bisindolylmaleimide(BIM,5μmol/L)可使pH 6．5时增大的,ⅠNa.P明显减小,开放概率和开放时间分别从0．214±0．024和(1．634±0．137)ms回落到0．025±0．006和(0．914±0．070)ms(P<0．01 vs pH 6．5,n=6)。结果表明,细胞外pH值降低可诱发心室肌细胞ⅠNa.P增大,其机制可能与PKC的激活有关。     

时间分辨免疫荧光分析测定人血清铁蛋白

用一种新型非放射性免疫分析——时间分辨荧光免疫分析法测定人血清铁蛋白含量。方法灵敏度达2ng/ml;测量范围5—1500ng/ml;批内、批间变异系数分别为7.1±0.8％和10.0±1.3％(x±SD);回收率为98.4±7.4％。测定值与RIA法测定值比较,相关性良好。     

血管钠肽抑制异丙肾上腺素增强的大鼠心肌细胞钙瞬变

采用光谱荧光法研究血管钠肽(vasonatrin peptide,VNP)对心肌细胞内钙瞬变的作用及其机制,观察钠尿肽鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase,GC)受体的特异性阻断剂(HS-142-1)、8-溴-环磷酸鸟苷(8-Br-cGMP)和镁蓝(methylene blue,MB)对心肌细胞内钙瞬变的影响。结果显示,异丙肾上腺素(isoproterenol,Iso)(10~(-10)～10~(-6)mol/L)可剂量依赖性地引起心肌细胞内钙瞬变增强,相对于对照组分别增强(13±8)%(P>0.05)、(26±13)%(P<0.05)、(66±10)%(P<0.01)、(150±10)%(P<0.01)和(300±25)%(P<0.01)。此效应可被β肾上腺素受体阻断剂普萘洛尔(10~(-6)mol/L)所阻断。VNP(10~(-10)～10~(-6)mol/L)可剂量依赖性地抑制Iso(10~(-8)mol/L)引起的心肌细胞内钙瞬变幅值的升高,相对于Iso(10~(-8)mol/L)分别减弱(99±3)%(P>0.05)、(96±2)%(P<0.05)、(84±6)%(P<0.01)、(66±3)%(P<0.01)和(62±3)%(P<0.01)。8-Br-cGMP(10~(-7)～10~(-3)mol/L)也可剂量依赖性地抑制Iso(10~(-8)mol/L)引起心肌细胞内钙瞬变的增强。HS-142-1(2×10~(-5)mol/L)使VNP的作用几乎完全消失。MB是GC的抑制剂,10~(-5)mol/L MB不但使VNP的作用完全消失,而且增强Iso对心肌细胞内钙瞬变的效应。VNP和HS-142-1本身对心肌细胞内钙瞬变无显著影响。而MB使心     

地高辛标记探针在Southern杂交分析中的技术要点

外源基因是否成功导入受体材料的基因组中 ,必须从转化植株中找到分子生物学的检测证据。目前 ,PCR、Southern杂交等作为常用检测手段而被广泛采用。虽然 PCR技术可以快速得到结果 ,但是 ,以农杆菌介导的材料必须慎重这一结论 ,以免由于农杆菌污染造成假阳性。而 Southern分析由于操作程序繁琐 ,对植物基因组DNA的提取、纯化、酶切等技术要求较高 ,有时使杂交结果不甚理想。我们在植物基因转化的研究中 ,对荞麦 ,桑树 ,紫景天 ,洋麻等基因组 DNA的提取、纯化、酶切进行了探讨 ,对流程中的有关步骤进行技术改良 ,使酶切后的 PNA在凝胶…     

甜菜坏死黄脉病毒的分离提纯及其生物化学特性的研究

本研究工作中,建立了一个有效的甜菜坏死黄脉病毒的分离提纯程序,解决了该病毒粒体易于聚集难以提纯的问题,其操作要点是,(1)通过Sepharose 2B柱层析代替超离心,有效地除去一些小分子量核酸杂质;(2)经PEG再次沉淀浓缩后,调整pH至酸牲(pH3.0),使病毒充分悬浮以减少凝聚;(3)在病毒等电点(pH4.8～4.9)条件下,进一步沉淀以纯化病毒。根据病毒提取物的OD260/OD280比值,算出核酸含量约4.5％。核酸电泳出现4条带,分子量分别为:2.25×10~(?),1.8×10~(?),1.05×10~(?),0.75×10~(?)道尔顿。病毒提取物经超速离心出现4个界面,沉淀系数分别为,200.8S,165S,125.8S,100S。说明甜菜坏死黄脉病毒可能是4组分病毒粒体。病毒粒体含一蛋白亚基,分子量约为2.05±0.05×10~4道尔顿,由16种共199个氨基酸组成。     

小剂量辣椒素对豚鼠心室肌细胞L-型钙电流的影响

应用全细胞膜片钳技术研究低浓度辣椒素(capsaicin,CAP)对单个豚鼠心室肌细胞L-型钙电流的影响及其作用机制.CAP(1～25 nmol/L)可浓度依赖性增加电压依赖性的ICa-L的峰值并下移I-V曲线.CAPl,10,25 nmol/L使ICa-L最大峰值分别由-9.67±0.7pA/pF增至-10.21±0.8pA/pF(P＞0.05),-11.37±0.8pA/pF和-12.84±0.9pA/pF(P＜0.05).CAP25nmol/L可明显使稳态激活曲线左移,激活中点电压(V0.5)由-20.76±2.0mV变至-26.71±3.0mV(P＜0.05),表明低浓度CAP改变了钙通道激活的电压依赖性.CAP25nmol/L对电压依赖性稳态失活曲线和ICa-L从失活状态下复活过程无明显影响.辣椒素受体(VR1)阻断剂钌红(RR,10μmol/L)可阻断低浓度辣椒素的效应.以上结果表明,低浓度辣椒素使钙通道稳态激活曲线左移,增加ICa-L,这一效应可能由VRl介导.     

Ca2+对黄瓜子叶离体培养物花芽分化的影响

黄瓜子叶离体培养物分化培养0～8d期间,添加Ca2+有利于花芽分化,花芽分化率可从Ca2+0mmol/L的(7.9±5.6)%上升到Ca2+6mmol/L的(31.7±4.0)%;0～2d和2～4d无钙脉冲处理不利于花芽分化,高钙脉冲处理的花芽分化率比对照略高;4～6d和6～8d高钙脉冲不利花芽分化,而无钙脉冲处理使花芽分化率上升很多。尤其是在4～6d,高钙处理使花芽分化率从(22±1.5)%下降到(15.7±3.5)%。而无钙处理使花芽分化率从(22.4±1.4)%上升到(43±3.5)%。表明0～8d期间不同时间段对Ca2+的需求是有差别的。相关性分析表明0～8d期间外源Ca2+影响花芽分化率与总芽中花芽比例极显著相关,提示Ca2+可能影响子叶向花芽或营养芽分化的趋势。本文结合已报道的黄瓜子叶培养物花原基形成的时程,分析了Ca2+对花原基形成和分化的影响。     

番茄叶片基因组DNA快速制备技术及其在基于实时荧光定量PCR的转基因检测中的应用

以番茄(Solanum lycopersicum L.cv.Micro-Tom)叶片为试材,建立了一种简便快速制备叶片基因组DNA的方法。2~20 mm2的叶片即可满足制备要求,制备过程只需一种提取试剂、只涉及1次移液和1次离心操作,不涉及沉淀。确定了所制备的DNA用于实时荧光定量PCR的合适用量为0.1~0.2μL(反应总体积为12.5μL),发现过量模板的使用可降低PCR效率且可导致扩增失败。该项DNA快速制备及相适应的实时荧光定量PCR技术已成功应用于番茄转基因植株检测。     

急性缺氧对家兔肺表面活性物质的影响

通过对呼吸氮氧混合气模拟缺氧（4800m,3h)的家兔肺表面活性物质变化的研究,我们发现：肺支气管灌洗液中磷脂含量下降59.82%（P<0.05)。肺匀浆中磷脂含量变化,特别是细胞内磷脂呈代偿增加的趋势,稳定性比率随时间的延长而逐渐下降,在15min时,缺氧组与对照组稳定性比率分别为0.88±0.02和0.98±0.01(P<0.05)。缺氧3h,呼吸参数如潮气量,每分钟通气量和食道内压均无显著变化,缺氧组和对照组用以反映P-V关系的A值分别为25.90±3.19和25.16±2.30;B值分别为7.94±1.82和6.56±1.09(P<0.05)。本实验结果说明缺氧（4800m,3h)致肺泡内衬活性物质下降,而在缺氧初期,细胞内磷脂有代偿增加的倾向,这种变化对呼吸功能及肺应变能力无影响。     

Ca2+对黄瓜子叶离体培养物花芽分化的影响

黄瓜子叶离体培养物分化培养 0～ 8d期间 ,添加Ca2 有利于花芽分化 ,花芽分化率可从Ca2 0mmol/L的 (7.9± 5 .6 ) %上升到Ca2 6mmol/L的(31.7± 4.0 ) % ;0～ 2d和 2～ 4d无钙脉冲处理不利于花芽分化 ,高钙脉冲处理的花芽分化率比对照略高 ;4～ 6d和 6～ 8d高钙脉冲不利花芽分化 ,而无钙脉冲处理使花芽分化率上升很多。尤其是在 4～ 6d ,高钙处理使花芽分化率从 (2 2± 1.5 ) %下降到 (15 .7±3 .5 ) %。而无钙处理使花芽分化率从 (2 2 .4± 1.4) %上升到 (4 3± 3 .5 ) %。表明 0～ 8d期间不同时间段对Ca2 的需求是有差别的。相关性分析表明 :0～ 8d期间外源Ca2 影响花芽分化率与总芽中花芽比例极显著相关 ,提示Ca2 可能影响子叶向花芽或营养芽分化的趋势。本文结合已报道的黄瓜子叶培养物花原基形成的时程 ,分析了Ca2 对花原基形成和分化的影响     

黑木耳漆酶纯化及部分漆酶特性的研究

黑木耳漆酶研究可为漆酶的进一步分离纯化、基因克隆表达和大规模生产应用奠定基础。对黑木耳"黑29"菌株漆酶粗酶液进行硫酸铵分级沉淀后,通过Native SDS-PAGE电泳检测,存在3种漆酶LacA、LacB、LacC,分子量分别为60,34,19 kD。经硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sephacel柱层析技术分离得一纯化成分LacC,纯化倍数7.60,酶活性回收4.28%。对LacC的pH、温度、金属离子和Km值等部分酶学性质进行研究发现,该酶氧化ABTS的Km值为1.18×10-6mol/L,催化氧化底物ABTS的最适pH为3.8,在pH 3.0~4.6表现出较强的稳定性;最适反应温度为55℃,低于50℃时有较好的热稳定性;金属离子Ag+对漆酶有激活作用,而Fe3+、Mn2+、Co2+则有抑制作用。     

Amiloride和Ni2+抑制缺血/复灌引起的大鼠心肌细胞内钙的增加

本文旨在研究Na+/H+交换以及Na+/Ca2 +交换对模拟缺血 /复灌引起的大鼠心肌细胞内游离钙水平变化的调节作用。分别利用模拟缺血液和正常台氏液对大鼠心肌细胞进行缺血 /复灌处理 ,在缺血期间分别应用Na+/H+交换抑制剂阿米洛利 (amiloride)、Na+/Ca2 +交换抑制剂NiCl2 以及无钙液 ,观察它们对细胞内游离Ca2 +浓度变化的影响。利用Zeiss LSM 5 10激光共聚焦显微镜检测、采集细胞内游离Ca2 +的指示剂Fluo 3 AM的荧光信号 ,计算出相对于正常(缺血前 )的相对荧光强度 ,以表示胞内游离Ca2 +浓度的变化。结果显示 ,模拟缺血引起大鼠心肌细胞内游离Ca2 +持续上升 ,缺血前的相对荧光强度值为 10 0 % ,模拟缺血 5min后为 140 3± 13 0 % (P <0 0 5 ) ,复灌 15min后为 142 8±15 5 % (P <0 0 5 )。经 10 0 μmol/Lamiloride、5mmol/LNiCl2 和无钙液分别预处理 ,模拟缺血 5min后的相对荧光强度分别为 10 1 4± 16 3 % (P <0 0 5 )、110 4± 11 1% (P <0 0 5 )和 10 7 1± 10 8(P <0 0 5 ) ;复灌 15min后则分别为 97 8±14 3 % (P <0 0 5 )、10 6 2± 14 5 % (P <0 0 5 )和 10 6 6± 15 7(P <0 0 5 )。另外 ,与对照组细胞相比 ,再灌注期间NiCl2和无钙液处理的细胞钙振荡的产生幅度明显减弱 ,amilorid     

正辛酸沉淀在单克隆抗体纯化中的工艺优化与应用

为应对治疗性抗体快速增长的市场需求,抗体上游细胞培养规模和表达量水平已显著提高,而下游纯化工艺的生产效率则相对落后,下游处理能力已成为限制抗体产能的瓶颈。本研究以单克隆抗体mab-X为实验材料,优化了细胞培养液、低pH病毒灭活收集液2种模式的正辛酸(caprylic acid,CA)沉淀工艺条件,并研究了CA处理去除聚体、CA处理灭活病毒等2种应用,在小试的基础上,采用低pH病毒灭活收集液CA沉淀的模式进行了500 L细胞培养规模生产放大研究,对沉淀前后的产品质量和收率进行了检测和对比。结果显示,两种模式的CA沉淀均可显著降低宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留和聚体含量,在聚体去除实验中CA沉淀可去除约15%的聚体,病毒灭活研究显示CA对逆转录模型病毒具有完全的病毒灭活能力。在放大生产规模中,下游依次进行了深层过滤收获、亲和层析、低pH病毒灭活、CA沉淀及深层过滤、阳离子交换层析,CA沉淀过程中混合时间和搅拌速度显著影响CA沉淀效果,CA沉淀处理后低pH病毒灭活液中的HCP残留量降低了895倍,沉淀后产品纯度和HCP残留均已控制在单克隆抗体质量要求范围内,CA沉淀可以减少传统纯化工艺中的一个精纯步骤。总之,下游工艺中采用CA沉淀,能够精简传统纯化工艺,并完全满足mab-X的纯化质量要求,而且能提高生产效率、降低生产成本。本研究结果将推动CA沉淀在单克隆抗体下游纯化生产中的应用,为解决目前传统纯化工艺的问题提供参考。     

犬胃内pH值和胆红素的持续监测

目的研究犬胃内pH值和胆汁反流的特点.方法应用便携式pH监测仪和便携式光纤分光光度仪(Bilitec 2000),持续监测禁食状态下5只犬胃内的pH值和胆红素吸光值(abs),每只犬同条件下监测2次,共进行10次监测.结果 pH值的波动范围1.2～7.8, 平均5.4±0.5,pH>4的时间百分比为(91.2±7.3)%.10次监测中仅1次胆汁反流阳性,其他9次abs的波动范围为0～0.20,平均0.08±0.02.结论犬胃内pH水平较人高.首次将Bilitec用于犬胃内胆红素的检测,发现胆汁反流发生率较低,建议以abs>0.20为犬胃内胆汁反流的诊断标准.     

胞外pH降低对肺动脉平滑肌细胞膜上电压门控性钾通道的调节

目的：观察pH对大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）钾电流的调控作用并探讨其机制。方法：用全细胞膜片钳技术记录在正常细胞外液和不同pH的灌流液中,PASMCs膜上电压门控性钾电流大小（Ikv）,并分析了其电生理学特性的改变。结果：①胞外pH降低可快速可逆性抑制Ikv。,与对照相比（pH7.4）,pH值为7.0、6.5、6.0时,＋60mV处的峰电流的抑制率分别为：16.93％±2.47％、33.03％±2.13％、41.59％±6.53％,电流一电压关系曲线右下移。②胞外pH为7.0、6.5、6.0时,使电压依赖性Gk-Em向去极化方向移动。同时使半激活电压增加。结论：在缺氧所致缺氧性肺血管收缩反应（HPV）的发生中,胞外pH的降低可参与对Ikv的调节,从而使细胞膜去极化,Ikv减小电压门控钙通道打开,平滑肌细胞收缩,这可能是缺氧导致HPV的机制之一。     

聚丙烯酸分离纯化苦瓜种仁碱性蛋白的方法及影响因素

以苦瓜籽为材料,研究了聚丙烯酸分离纯化苦瓜种仁碱性蛋白的方法及影响因素。等电点沉淀试验表明,柠檬酸、盐酸分别调节苦瓜种仁粗提液pH至6.0、4.0时,各有14.62%和32.49%的苦瓜种仁蛋白被沉淀。醋酸的等电点沉淀作用呈现阶段性特点,pH 6.0和4.0时分别有26.17%和38.72%的苦瓜种仁蛋白被沉淀。醋酸、盐酸和柠檬酸处理的1mL苦瓜种仁粗提液（pH 4.0）,1%PAA选择性沉淀碱性蛋白（等电点pI为8.65～9.30）的最佳用量分别为100μL、120μL和100μL。醋酸调节苦瓜种仁粗提液pH分别至5.0、4.0和3.0,等电点沉淀后的上清液用PAA沉淀碱性蛋白,当PAA（1%）用量为160μL/mL提取液时,pH5.0和3.0样液分别有33.77%和43.56%蛋白质被沉淀;当PAA用量为120μL/mL提取液时,pH 4.0样液中30.83%蛋白质被沉淀。PAA-蛋白质复合物溶解于碱性溶液（pH＞9.0）,当溶液NaCl浓度为3.0%时,溶液蛋白质浓度最高。PAA选择性沉淀的苦瓜种仁碱性蛋白经Sephadex G-75柱层析分离,分别在175min和300min出现主峰Ⅰ和Ⅱ。SDS-PAGE和IEF分析表明主峰Ⅰ的分子量约为30kD,pI值约为9.5,主峰Ⅱ的分子量约为10kD,pI值约为9.3。     

嗜热厌氧乙醇菌JW200转化条件的研究

摘要 嗜热厌氧乙醇菌遗传转化系统的缺少,制约了对该菌理论基础和应用领域的进一步研究。利用聚乙二醇（PEG6000）转化和电转化技术国际首次实现了嗜热厌氧乙醇菌JW200外源基因的导入。PEG转化效率很低,因此选择对电转化条件进行优化,转化效率从4±3.2个转化子/μg质粒DNA提高到50±7.4个转化子/μg质粒DNA。实验表明获得较高的转化效率的必要条件是在细胞密度为OD660 0.2时添加甘氨酸与蔗糖后继续培养2h以及细胞在电击前的收集与洗涤保持低温。本研究为利用基因工程手段改造嗜热厌氧乙醇菌和从分子水平研究胞内乙醇代谢途径奠定了基础。