尼罗罗非鱼生长激素及其受体的cDNA克隆与mRNA表达的雌雄差异

尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)雌雄鱼生长差异明显,为了探讨其原因,本文采用RT-PCR方法克隆了尼罗罗非鱼生长激素(Growthhormone,GH)及其受体(Growth hormone receptor,GHR)的cDNA序列,并应用半定量RT-PCR方法比较了雌、雄尼罗罗非鱼垂体GHmRNA、肝脏GHRmRNA、肌肉GHRmRNA的表达差异。序列分析表明:GH开放阅读框为615bp,共编码204个氨基酸;GHR开放阅读框为1908bp,共编码635个氨基酸。以RT-PCR方法研究了GH、GHR在各组织的分布情况,结果表明:GH仅在垂体中检测到有表达,而GHR在所检测的18种组织中均有表达,其中以肝脏、肌肉、性腺、下丘脑、胸腺表达量较高。以半定量RT-PCR方法进一步比较了雌、雄尼罗罗非鱼垂体GHmRNA、肝脏GHRmRNA、肌肉GHRmRNA的表达量,结果表明:雄鱼垂体GHmRNA和肝脏GHRmRNA的表达量均显著高于雌鱼,肌肉GHRmRNA的表达量则无显著差异,推测垂体GHmRNA和肝脏GHRmRNA表达的雌雄差异是尼罗罗非鱼雌雄生长差异的主要原因之一。     

IGF—ImRNA在不同年龄鲤表达的差异和LHRH—A对IGF—ImRNA表达的影响

利用RNA酶保护法对7月龄性未成熟幼鲤和2龄性成熟鲤组织胰岛素样生长因子-I（IGF-I）mRNA的表达水平进行测定,结果表明成鱼肝和肾脏组织IGF-ImRNA的丰度显著高于幼鱼,对鲤成鱼和幼鱼腹腔注射促性腺激素释放激素类似物（LHRH-A,D-Ala^6-Pro^9-NEt-LHRH)使血清生长激素（GH）水平和肝组织IGF-ImRNA水平都显著升高,而成鱼生殖腺IGF-ImRNA的丰度比对照组显著增加,研究结果提示鲤在不同发育阶段肝组织IGF-ImRNA的丰度比对照组显著增加,研究结果提示鲤在不同发育阶段肝组织IGF-ImRNA的表达存在差别,其中2龄成鱼大于7月龄幼鱼;LHRH-A可能通过刺激垂体GH的释放间接促进肝组织IGF-ImRNA的表达,亦可能通过某种未知途径刺激生殖腺IGF-ImRNA的表达。     

乙炔基雌二醇(EE2)对雄性黄颡鱼GtH3个亚基基因表达的影响

为研究乙炔基雌二醇(EE2)是否能影响雄性黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)垂体中促性腺激素3个亚基基因的表达,从而干扰FSH和LH的分泌,研究采用末端快速扩增(RACE)的方法在黄颡鱼垂体中克隆了促性腺激素的2个亚基(FSH和LH)的全长cDNA,对其组织表达模式和雌雄性垂体中的季节表达模式进行了研究;另外,研究还用100 ng/L的EE2对雄性黄颡鱼(2龄)进行了28d的暴露处理。结果发现,黄颡鱼FSH cDNA全长528 bp, ORF为399 bp,编码132个氨基酸; LH全长为870 bp, ORF为417 bp,编码138个氨基酸。序列分析结果表明,黄颡鱼FSH含有一个17氨基酸的信号肽, 2个保守的N-糖基化位点和13个半胱氨酸残基,而LH含有一个18个氨基酸的信号肽, 1个N-糖基化位点和12个半胱氨酸残基,与其他鲶形目鱼类极其相似。进化分析显示,黄颡鱼FSH和LH与鲶形目的鱼类进化关系较近。组织分布结果发现,黄颡鱼3亚基均仅在垂体中表达。季节表达模式结果表明,雌雄黄颡鱼GtH和LH表达水平在5月份左右达到最高,随后降低; FSH在雌性的表达模式与GtH和LH相同,而在雄性, FSH的表达没有明显变化。半定量RT-PCR结果显示, 100 ng/L的EE2能显著抑制黄颡鱼促性腺激素3个亚基基因的表达。研究认为, EE2抑制黄颡鱼雄性垂体FSH和LH的分泌,可能阻碍其正常的精子发生、精子成熟和排精过程,从而影响其正常的繁殖和发育。       

红鳍东方鲀转录因子GATA4基因的表达

利用荧光实时定量PCR(q RT-PCR)技术对红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)成鱼的肾脏、肌肉、脑、脾脏、肝脏、精巢和卵巢等组织进行了GATA4基因的表达分析,并对幼鱼不同发育时间的个体水平上的GATA4基因的表达进行分析。结果显示,红鳍东方鲀成鱼的肌肉、脾脏、肾脏和脑等4个组织中的GATA4的表达量差异不显著,精巢、卵巢和肝脏的GATA4的表达量显著高于其他组织(P0.05),GATA4在精巢、肝脏中的表达量显著高于卵巢中(P0.05)。在雄性幼鱼5个发育时期中(23、30、40、60和80日龄),GATA4的表达量从23日龄到30日龄逐渐升高,30日龄最高且明显高于同时期雌鱼GATA4的表达量(P0.01),随后到40日龄之间表达量逐渐降低,从60日龄到80日龄又有上升的趋势。在雌性幼鱼5个发育时期中,GATA4表达量从23日龄到40日龄逐渐升高,40日龄最高且明显高于同时期雄鱼GATA4的表达量(P0.01),到60日龄期间表达量降低,从80日龄后又有上升趋势。各时期雌雄幼鱼,除40日龄外,其他各个时期在雄性中GATA4的表达量均高于在雌性中的表达量。     

鲤鱼两个cGnRH-Ⅱ基因的发现及其在成熟个体的表达分析

促性腺激素释放激素(GnRH)是一个保守的神经十肽家族, 在调节脊椎动物的性腺发育和控制性成熟中起至关重要的作用. 用RACE和RT-PCR方法, 从鲤鱼脑组织克隆得到两个差异的cGnRH-Ⅱ cDNAs序列, 其长度分别为622, 578 bp. 两个cDNA编码的cGnRH-Ⅱ前体均为86个氨基酸, 包括一个信号肽、cGnRH-Ⅱ十肽和一个由蛋白水解位点(Gly-Lys-Arg)连接的GnRH相关肽. 内含子捕获和Southern杂交证实鲤鱼基因组中有两个cGnRH-Ⅱ编码基因, 且两个基因都可能以单拷贝形式存在. 鲤鱼cGnRH-Ⅱ的多基因编码现象为“基因复制”理论提供了新的证据. 采用半定量的RT-PCR分析了两个cGnRH-Ⅱ基因在鲤鱼成熟个体的脑区、垂体和性腺中的表达及相对表达水平. 表达分析结果表明, 脑区、垂体和性腺都能检测到cGnRH-Ⅱ基因的表达, 但cGnRH-Ⅱ基因在卵巢没有表达是例外, 而表达水平在不同的脑区、垂体和性腺存在差异. 根据两个cGnRH-Ⅱ基因的广泛表达特性, 推测鲤鱼cGnRH-Ⅱ的功能可能主要起神经递质或神经调节剂作用, 同时对促进和调控促性腺激素释放起一定作用, 而在垂体和性腺合成的cGnRH-Ⅱ可能起自分泌和旁分泌调节因子的作用.     

达氏鲟生长激素基因cDNA克隆、表达及免疫荧光定位研究

为研究达氏鲟(Acipenser dabryanus)生长激素(Growth Hormone, GH)基因的功能, 合成了达氏鲟垂体SMART cDNA, 克隆得到GH全长cDNA序列。达氏鲟GH全长cDNA序列为1008 bp, 由52 bp的5'端非编码区(Untranslated region, UTR)、编码214个氨基酸的645 bp开放阅读框(Open reading frame, ORF)和311 bp的3'UTR构成。运用GH氨基酸序列构建进化树分析发现, 达氏鲟与两栖类、爬行类和哺乳类的一致性要高于真骨鱼类。实时荧光定量PCR结果表明, 达氏鲟GH mRNA主要在垂体和下丘脑中表达, 且垂体中GH的表达量约为下丘脑的110倍; Western-blot研究结果与qRT-PCR一致, 仅在垂体和下丘脑中检测到生长激素蛋白, 且垂体中GH的表达量远高于下丘脑。免疫荧光定位结果显示, GH主要定位于垂体中部, 下丘脑中也有少量荧光信号; 苏木精-伊红组织切片染色研究表明, GH主要是由嗜酸性的生长激素分泌细胞分泌。研究为深入研究脊椎动物生长激素基因的进化和人工养殖达氏鲟的生长调控提供了基础。       

日粮能量水平对五指山猪初情期性腺轴KISS-1/GPR54 mRNA水平表达影响

本研究采用实时荧光定量PCR技术检测不同日粮能量水平对五指山猪初情期性腺轴Kiss-1、GPR54基因mRNA水平表达的影响。结果显示,在NRC和0.7 NRC两组实验猪的下丘脑、垂体、卵巢组织中均检测到Kiss-1、GPR54基因mRNA水平的表达;NRC组在下丘脑和卵巢kiss-1 mRNA表达量显著高于0.7NRC组(p0.05),在垂体中的表达差异不显著(p0.05);日粮能量水平对初情期性腺轴GPR54 mRNA表达差异不显著(p0.05)。说明KISS-1/GPR54系统对动物初情表达的调节作用可能是通过调节下丘脑KISS-1基因的表达来实现。结果表明kiss-1 mRNA的表达规律在NRC组和0.7NRC组间保持一致,表达量依次为:下丘脑垂体卵巢;GPR54 mRNA的表达规律在NRC组和0.7NRC组间也保持一致,表达量依次为:卵巢垂体下丘脑,表明不同日粮水平的摄入并不影响Kiss-1、GPR54基因在各个组织中的表达规律。     

绵羊发情周期不同组织Cry1mRNA 转录水平相对定量研究

研究表明,时钟基因Cry1在哺乳动物季节性繁殖内分泌过程中可能发挥了重要作用。文章以多浪羊(非季节性繁殖)和中国美利奴羊(季节性繁殖)为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术对下丘脑-垂体-性腺轴主要组织Cry1在发情周期不同阶段的表达变化情况进行了跟踪检测。结果表明:绵羊Cry1在所检测组织中均有表达,其中松果体和甲状腺Cry1的表达水平较高;不同绵羊品种Cry1在发情周期不同阶段的组织表达谱基本一致,除下丘脑外,卵巢、子宫、松果体、垂体和甲状腺中Cry1的表达水平均是在发情前期达到峰值;卵巢、子宫、垂体和松果体Cry1在发情前期和发情期的表达变化幅度存在显著的品种间差异。研究结果表明:Cry1可能具有启动发情和季节性繁殖的重要作用。     

不同发育阶段雄性小鼠睾丸组织mEppin基因mRNA的表达差异研究

目的实时荧光定量PCR检测雄性小鼠不同发育阶段睾丸组织中m Eppin基因的mRNA表达差异,为探究m Eppin基因表达与雄性生殖相关性提供生物学数据。方法分别选取胚胎期、50日龄、90日龄雄性ICR小鼠各6只,共18只,取各组小鼠睾丸组织提取总RNA,实时荧光定量PCR方法检测m Eppin基因mRNA表达水平。结果不同发育阶段小鼠睾丸m Eppin基因表达水平差异明显。胚胎组小鼠中没有检测到m Eppin基因mRNA表达,50日龄小鼠和90日龄小鼠中均检测到m Eppin基因mRNA有较高表达水平。其中,90日龄小鼠睾丸中m Eppin基因mRNA的相对表达水平是50日龄小鼠的2.65倍。结论本研究结果表明m Eppin基因mRNA的表达在小鼠睾丸组织中具阶段特异性。     

草鱼生肌因子5基因的克隆及其组织表达谱分析

目的:获得草鱼生肌因子5(Myf-5)基因序列,分析其在草鱼不同组织和不同发育阶段中的表达规律。方法:根据鲤鱼Myf-5基因序列设计引物,用草鱼肌肉组织总RNA,经RT-PCR扩增其Myf-5基因序列;利用半定量RT-PCR分析草鱼Myf-5基因在草鱼不同组织和不同发育阶段的mRNA表达特性。结果:获得了草鱼Myf-5基因开放读框序列723 bp,GenBank登录号为GU290227;该基因编码由240个氨基酸残基组成的蛋白,具有MyoD家族基因的典型性碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构,其氨基酸序列与斑马鱼、鲤鱼、虹鳟、大西洋鲑等的同源性较高(74%~97%),与哺乳动物和禽类如人、小鼠、大鼠、猪、牛和鸡的同源性较低(56%~60%);在草鱼红肌、白肌、肝胰脏、肾脏、脑和肠中均检测到Myf-5基因的表达,红肌、白肌和脑组织中Myf-5基因mRNA的表达量显著高于其他组织(P<0.05);草鱼Myf-5基因的表达随着其生长发育呈下降趋势,在较大规格试验鱼(500 g)中的表达显著低于其他2种规格(50~60 g、120~130 g)的试验鱼(P<0.05)。结论:获得了草鱼Myf-5基因序列,其在红肌、白肌和脑组织中的表达量显著高于其他组织,并随生长发育呈下降趋势,为研究Myf-5在草鱼肌肉发育过程中的作用提供了基础资料。     

石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽和生长激素释放激素基因的cDNA克隆及表达分析

垂体腺苷酸环化酶激活多肽 (PACAP)和生长激素释放激素 (GHRH)均属于血管活性肠肽家族成员 ,且两者前体基因在脊椎动物的鸟类、两栖类、鱼类中由同一基因编码 ,而哺乳动物是由两个不同基因编码。已有几例关于鱼类编码PACAP和GHRH基因克隆的报道 ,而关于重要海水养殖鱼类石斑鱼的PACAP和GHRH基因未见报道。克隆了PACAP GHRH前体cDNA序列 ,该前体有两种剪接方式 ,包括一个长序列和一个短序列 ,其中长序列编码PACAP和GHRH ,短序列缺失 10 5个碱基 ,仅编码PACAP而缺失编码GHRH的外显子区 ,同样情况在虹鳟和沟鲶中也有报道。通过半定量RT PCR方法对石斑鱼PACAP GHRH前体mRNA在胚胎发育和发育早期以及各部位的表达情况进行了分析。胚胎发育分析结果表明 ,从神经胚期开始 ,PACAP GHRH前体mRNA大量表达 ,提示该蛋白质在神经发育或神经营养方面具有重要作用。PACAP GHRH前体基因在中枢系统的表达量远高于外周组织。在鱼类的眼和鳃发现PACAP GHRH前体分布。