相思根瘤菌培养基优化及其固氮酶活性研究

研究了 2株相思根瘤菌在 4种培养基中的生长情况 ,并在此基础上应用正交实验L9(34 )对相思根瘤菌进行优化培养基研究 ,筛选出相思根瘤菌优化培养基配方。结果表明 :MZ菌株与YM2菌株在各自优化培养基的菌体数量高达 8.2× 10 9个 mL与 6 .3× 10 9个 mL ,分别为原有培养基的 3.6 4倍与 1.14倍 ;另外用乙炔还原法测得它们的最高固氮酶活性分别为 0 .96 3μg .mL- 1 .d- 1 与 0 .2 80 μg .mL- 1 .d- 1 。     

玫瑰黄链霉菌NKZ-259发酵培养基的优化

玫瑰黄链霉菌NKZ-259是一株生防菌株,其次级代谢能产生植物生长调节类物质吲哚乙酸(IAA)。为了进一步提高菌株代谢产生IAA的含量,本试验对该菌株的发酵培养基进行了优化。利用单因子试验确定发酵培养基中最适的6种营养成分为葡萄糖、可溶性淀粉、蛋白胨、硝酸钾、磷酸氢二钾和L-色氨酸;通过Plackett-Burman设计筛选出影响菌株发酵产生IAA的主要因素为L-色氨酸、葡萄糖和磷酸氢二钾;采用中心组合试验(CCD)及响应面法分析各因素的交互作用。最终确定菌株代谢产生IAA的最优发酵培养基为:L-色氨酸2.24 g/L,葡萄糖20.7 g/L,磷酸氢二钾0.5 g/L,可溶性淀粉10 g/L,蛋白胨3 g/L,硝酸钾4.5g/L;使用优化后的发酵培养基菌株代谢产生IAA的含量为45.377 4μg/mL,比原始发酵培养基IAA的含量提高了3倍。     

解脂耶氏酵母诱变育种及发酵产α-酮戊二酸条件优化

对具有发酵产α-酮戊二酸能力的解脂耶氏酵母(Yarrowia Lipolytica)ZY-4进行了紫外诱变和NTG诱变育种,筛选得到产量提高的突变株,并对突变株的发酵培养基进行了优化,结果表明,紫外诱变和NTG诱变后筛选到的突变株分别比原始出发菌株产量提高了67.8%和110%。优化后发酵培养基成分为甘油8%,氯化铵5.0 g/L,硫胺素1.0μg/L,磷酸二氢钾1.0 g/L,七水硫酸镁0.5 g/L,培养基优化后α-酮戊二酸产量比原始出发菌株提高了232.4%。     

紫外诱变筛选海洋红酵母S8的尿嘧啶缺陷型菌株

本课题组从海南天然海域筛选到一株高产类胡萝卜素的海洋红酵母菌株S8,该菌株对鱼无毒害,并与鱼共生,欲将其应用于盐诱导表达外源蛋白的海洋红酵母工程菌的构建。本研究利用紫外诱变筛选的方法处理S8菌株,通过统计其UV致死率、5-氟乳清酸致死率等筛选S8的尿嘧啶营养缺陷型突变株。研究结果表明,供试菌株通过紫外线诱变、5-氟乳清酸致死和回复突变率的实验筛选,共获得16株稳定的尿嘧啶缺陷型突变株,突变菌株在基本培养基中培养了8d仍不能生长。选择了其中的一株ST5进行了产胡萝卜素能力的测定,结果表明,在同样的培养条件下,野生型S8菌株细胞生物产量可达87.55g/L,类胡萝卜素含量可达520μg/g,突变株ST5的细胞生物产量为85.45g/L,类胡萝卜素含量为512μg/g;ST5的产胡萝卜素能力方面与野生型S8无明显差异。因此,尿嘧啶缺陷型菌株ST5可为下一步海洋红酵母工程菌的构建提供受体菌。     

根瘤菌4012a菌株产细胞分裂素发酵条件的研究

用酶标免疫检测法研究了根瘤菌4012a菌株细胞分裂素发酵的适宜培养基和培养条件。结果表明,其最佳培养基为（g／L）：葡萄糖10.0,（NH4）2SO41.0,K2HPO4·3H2O0．6,MgSO4·7H2O0.1,CaCl2·2H2O0.4,FeCI3·6H2O0．04,Na2MoO4·2H2O0．1mg／L,泛酸钙100μg／L,腺漂吟200mg／L。该菌株在150r／min的旋转摇床上27℃振荡培养96h,发酵液中细胞分裂素产量可达908μg／L,生物活性（萝卜子叶扩大法）为1mg／L激动素当量。     

茎瘤固氮根瘤菌甲基化受体蛋白Tlp1的功能

【目的】考察茎瘤固氮根瘤菌中趋化基因簇上游的受体蛋白Tlp1编码基因的突变表型,初步探究其功能机理。【方法】利用同源重组和三亲本接合转移的方法构建突变株,在TY培养基中测定生长情况,半固体平板法观察趋化圈,刚果红固体培养基观察胞外多糖和次生代谢产物的分泌,乙炔还原法测定菌株的固氮酶活性。【结果】与野生型菌株相比,tlp1突变株的生长速率没有影响。在以甘油为碳源的L3半固体平板上突变株的趋化圈变小,其回补菌株能部分回补趋化能力。突变株的胞外多糖分泌与野生型没有区别,但其次生代谢产物黑色素出现的时间比野生型稍早。在固氮酶活性测定中,发现突变株酶活性明显比野生型降低,回补菌株能够部分回补。【结论】茎瘤固氮根瘤菌Tlp1蛋白对甘油表现出一定的趋化能力,并且影响细菌的次生代谢产物和固氮能力。     

蛋氨酸高产酵母突变株的推理筛选

以啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）菌株Ⅰ为出发株,经紫外线处理后,在含可完全抑制出发株生长的乙硫氨酸（浓度为2g/L）的基本培养从上筛出14株生长良好的突变株,其中I－2,I－9株还能在无硫基本培养基上良好生长。经氨基酸自动分析仪检测,I－2株菌体蛋白中的蛋氨酸含量（质量由分比）由I株的1．93增年9．28。     

紫外诱变驯化提高酿酒酵母木糖发酵的抑制物耐受性

利用驯化和紫外处理结合驯化的手段对一株木糖发酵工业菌株的抑制物耐受性进行提升。在反复批次培养过程中不断提高含9种抑制物的混合抑制物浓度,使细胞的生长和发酵逐渐适应高浓度抑制物环境,分离突变菌株并进行评价。紫外处理结合驯化比直接驯化能更有效的提升细胞对高浓度抑制物的耐受能力;通过突变菌株分离和筛选,获得3株抑制物耐受能力高于出发菌株的突变菌株,它们在抑制物浓度100%MI(甲酸1 g/L,乙酸3.5 g/L,乙酰丙酸1.5 g/L,糠醛1.5 g/L,5-羟甲基糠醛1.5g/L,丁香醛0.1 g/L,香草醛0.1 g/L,松柏醛0.025 g/L,肉桂酸0.025 g/L)条件下的木糖消耗率比出发菌株高出11.3%-23.2%。紫外诱变处理结合驯化过程可以有效提高酿酒酵母对混合抑制物的耐受性。     

Sinorhizobium fredii WGF03胞外多糖分泌相关基因exoD功能初探

从费氏中华根瘤菌WGF03的基因组中克隆出与胞外多糖分泌密切相关的基因exoD,研究该基因对胞外多糖合成、菌株共生结瘤能力和固氮效率的影响。利用自杀性质粒pK18mobsacB,通过同源双交换法构建exoD基因的缺失突变体ΔexoD。实验发现:与野生菌株相比,突变株在YMA培养基平板上胞外多糖产量明显减少、运动能力也有所减弱;在NaCl浓度小于350 mmol/L范围内,菌体均能维持稳定生长;接种于大豆幼苗后,产生的根瘤数量较多,但个体小、形状不一,且固氮酶活也显著下降。研究结果说明exoD基因参与S.fredii WGF03胞外多糖的合成并影响菌株共生结瘤能力和固氮效率。     

耐高渗拟布氏乳杆菌的富集选育

拟布氏乳杆菌K1(Lactobacillus parabuchneri K1)在厌氧条件下可以有效转化果糖生成甘露醇。但当果糖浓度逐步升高时,菌体生长及甘露醇产生速度减慢。为了提高K1菌株在高浓度果糖条件下的生长及转化速率,设计了定向富集耐渗突变株的实验,采用10 L发酵罐,在高渗条件下连续转接培养,培养过程中果糖质量浓度经4次梯度增加,从270 g/L增加到300 g/L。经55 d传代培养后分离纯化,获得耐渗突变株K2。通过2 L发酵罐验证试验,发现K2菌株在300 g/L果糖条件下,果糖利用速率提高103%,发酵周期缩短46.4%,甘露醇的平均产量达到189g/L,达到理论转化率的94.0%。     

谷氨酸棒杆菌ilvE基因的敲除对相关氨基酸合成的影响

L-缬氨酸是谷氨酸棒杆菌SYPS-062发酵生产L-丝氨酸的主要副产物.为减少L-缬氨酸的积累,利用基因重组技术敲除SYPS-062转氨酶B编码基因ilvE内部的987 bp核苷酸序列,构建了ilvE基因缺失突变株SYPS-062△ilvE.研究表明,重组菌ilvE基因的缺失直接导致了分支氨基酸(Val、Ile、Leu)的合成能力的降低,影响了菌体的生长,其中Ile成为生长限制性因子,在培养基中添加分支氨基酸能明显促进其生长.重组菌培养96 h,发酵液中L-缬氨酸含量低于0.5 g/L,与出发菌株相比,其生成率降低90％.     

耐铵型产琥珀酸放线杆菌的选育及铵离子对其生长代谢的影响

经硫酸二乙酯(DES)诱变,在含61～242mmol/LNH4+梯度平板中,筛选到一株耐铵型突变株YZ25,该菌株在含121mmol/LNH4+发酵培养基中,琥珀酸产量达32.68g/L,转化率为65.4%,比出发菌提高了180.5%。进一步考察了不同形态铵盐对YZ25生长的影响,结果表明添加少量铵盐能够提高突变菌的生长速率,但当超过一定量后菌株生长受到抑制,不同铵盐对菌株的抑制程度不同,硫酸铵、碳酸氢铵、氯化铵和硝酸铵对突变株YZ25的半抑制浓度分别为:215mmol/L、265mmol/L、235mmol/L、210mmol/L。为了考察铵离子对YZ25发酵产琥珀酸的影响过程,在3.0L发酵罐以氨水作为pH的调控剂发酵,结果表明在稳定期前菌株生长基本不受铵离子抑制,生物量能够达到正常水平,但是进入稳定期后铵离子抑制作用越来越明显,导致菌株生长提前结束,耗糖不完全,产酸受阻。最后结合产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes代谢途径分析了铵离子对菌株抑制作用的机理。     

L-异亮氨酸高产菌选育及其培养基优化

旨在诱变选育L-异亮氨酸高产菌,并探索突变株最佳发酵条件。利用传统化学诱变结合常压室温等离子体生物诱变体系对实验室保藏的Brevibacterium flavum I-12进行逐级诱变,选育2-噻唑丙氨酸(2-TA)和磺胺胍(SG)高抗性和在琥珀酸平板上能快速生长的突变菌株。随后,在单因素实验的基础上,利用响应面设计优化出目的突变株摇瓶发酵培养基组分的最佳参数水平。结果显示,经过一系列诱变和筛选,成功选育出一株在40 g/L的2-TA和5 g/L的SG,且以琥珀酸为唯一碳源的培养基上快速生长突变株,命名为B. flavum TA-6,该菌株产酸达26.2±0.5 g/L,比出发菌株提高了44.75%,而副产物L-缬氨酸和L-亮氨酸积累量明显降低。经响应面法优化发酵条件后,突变株产酸可达27.8±0.5 g/L,比优化前提高了6.1%。通过传统化学诱变结合ARTP生物诱变体系,成功选育出一株杂酸降低的L-异亮氨酸高产菌TA-6,该菌株具有潜在生产应用价值。     

丝孢酵母高甲硫氨酸突变株的选育及营养调控

以丝孢酵母(Trichosporon Behr)ST851为原始菌株,经紫外线诱变,在含乙硫氨酸的双层平板上筛选到多株抗乙硫氨酸突变株。其中ST851-10株抗乙硫氨酸浓度达到350μg/ml,其菌体蛋白质含量由40.5％提高到44.3％,菌体甲硫氨酸含量由20.45mg/g-DCW增加到29.32mg/g-DCW。在以苹果渣为碳源、尿素为氮源、硫酸镁作硫源的最适培养条件下,固态发酵24h后,蛋白质和甲硫氨酸含量较原始菌株分别提高了15.8％和44.9％。培养基中C/N值低有利于甲硫氨酸的合成,C/N值高则适合于菌体生长。在苹果渣固态发酵过程中,适当补加氮源既有利于菌体生长和甲硫氨酸的合成,又可起到调节培养基pH值的作用。     

空间搭载高产葡萄糖耐量因子(GTF)酵母的选育

以从本试验室收藏的7株酵母菌种及其7株经空间搭载(实践八号)诱变后的酵母菌株为研究对象, 通过梯度含铬YEPD平板培养和液体YPD培养基发酵试验, 利用氨水提取菌体中的GTF和火焰原子吸收光谱法检测其有机铬含量, 从中筛选出一株葡萄糖耐量因子的高产酵母(YS-3), 有机铬含量达1296 mg/g, 总铬含量达1926 mg/g, 生物量为40 g/L。同时分析了菌体发酵过程中, 菌体有机铬富集量与其它发酵参数的动态关系。     

青藏高原东麓高山豆［Tibetia himalaica(Baker)H.P.Tsui］根瘤菌的遗传多样性

【目的】分离纯化青藏高原东麓(四川甘孜藏族自治州)高山豆根瘤菌,揭示其遗传多样性。【方法】采用纯培养法从该地区高山豆植物根瘤中分离纯化根瘤菌;通过BOXAIR、16S rDNA-RFLP及PCA(PrincipalComponent Analysis)来分析高山豆根瘤菌的遗传多样性;通过16S rDNA序列同源性确定菌株的系统发育地位;通过测定菌株的耐盐性、初始pH生长范围及生长温度范围来分析高山豆根瘤菌的抗逆性。【结果】从8个县12个采样点共分离纯化出22个菌株。22个菌株在16S rDNA PCR-RFLP分析中聚成4个遗传群,在BOX-PCR分析中则聚成9个遗传群。高山豆根瘤菌16S rDNASimpson遗传多样性指数D=0.872。22个菌株分别属于Rhizobium(11/22株)、Mesorhizobium(4/22株)、Rhizobium-Agrobacterium(7/22株)3个属。生理性状测定试验表明,所有菌株均能在1%NaCl的YMA培养基上生长,大多数(15/22株)菌株能在4%NaCl的YMA培养基上生长,其中,SCAU679、SCAU694、SCAU706等3个菌株能在7%NaCl的培养基上生长,SCAU689能在8%NaCl的培养基上生长;15/22的菌株能在pH4-11的培养基上生长;16/22的菌株能在4-45℃条件下生长,所有菌株能在60℃(处理10 min后置28℃)条件下生长。【结论】青藏高原东麓(四川甘孜州)高山豆根瘤菌具有丰富的遗传多样性。大多数菌株对高盐、高温、低温及过酸过碱环境均具有很强的耐受能力。     

利用脂肪酸合成酶抑制剂和磷酸香草醛反应筛选高产油脂酵母菌

利用80 MeV/u碳离子束对产油菌株粘红酵母进行辐照诱变, 采用含有脂肪酸合成酶抑制剂cerulenin的培养基进行高产油脂突变株的初筛, 并通过磷酸香草醛反应和氯仿甲醇抽提法对初筛菌株油脂含量进行分析。结果表明, cerulenin对酵母细胞生长有较好的抑制作用, 浓度为8.96×10-6 mol/L时, 抑制率达98%以上, 可作为筛选浓度。通过磷酸香草醛反应法对初筛菌体油脂含量进行定量分析, 发现菌体油脂含量与该反应在530 nm处的光吸收成线性正相关, 初筛菌株的正突变率达65%以上。该方法快速方便, 是一种较为理想的产油酵母筛选方法。通过该方法, 筛选出了2株油脂含量高于对照90%以上的突变株。     

L-乳酸发酵菌株的选育

以初筛得到的 1株干酪乳杆菌鼠李糖亚种突变株R2 (Lactobcilluscaseisubsp .rhamnosusR2 )为出发菌株 ,经紫外线、硫酸二乙酯、复合诱变处理 ,筛选出 1株产乳酸较高的突变株ZY ,L 乳酸含量达 93.9%。以正交试验为基础对发酵培养基进行优化 ,采用优化后的培养基发酵 4d ,残糖降至 0 .1 %以下 ,L 乳酸产量达9.5 7g/ 2 0 0mL ,对糖的转化率达 96 .3%。     

Optimization of high cell-density fermentation of Lactobacillus casei with function of removing microcystin

为提高一株具有藻毒素清除能力的干酪乳杆菌Lactobacillus casei BBE10-212单位体积的活菌数,针对其营养需求,研究了不同碳源、氮源、缓冲盐、微量元素及生长因子对该菌株生长情况及发酵特性的影响.通过响应面法对碳源、氮源、生长因子等进行优化,获得最佳培养基配方为:α-乳糖43.8 g/L,酵母膏79.5 g/L,无水乙酸钠13.12 g/L,冰醋酸9.17 mL/L,MnSO4 ·H2O 190mg/L,吐温-80 5.15 mL/L.经37℃培养18 h,菌体干重达到4.97 g/L,比在普通MRS培养基中(1.32 g/L)提高近4倍.基于乳酸菌发酵过程中的产酸特性,通过外源添加5 g/L谷氨酸,促使菌体浓度进一步提高15％,并提前1.2h进入生长稳定期.上述研究结果为食品行业重要生产菌株干酪乳杆菌的高密度培养技术提供了可借鉴的研究思路.     

常压室温等离子体快速诱变产油酵母的条件及其突变株的特性

采用新型常压室温等离子体射流诱变产油酵母,结合快速突变产油酵母操作条件及基于96孔板的高通量筛选手段,获得了一系列增殖速度和产油量发生变化的突变株。在等离子体对菌株致死率为99％的条件下获得的以突变株增殖速度为指标的正突变率达到27.2％。用含酵母粉 (10 g/L)、蛋白胨 (10 g/L) 及葡萄糖 (20 g/L) 的酵母膏胨葡萄糖培养基进行发酵实验表明,筛选得到的高产突变体产油量从对照株的1.87％ (W/W) 增加到4.07％ (W/W)。