产1,3-丙二醇基因工程菌发酵条件的研究

利用途径工程的方法,将来源于克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脱水酶基因dhaB和1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT构建成多顺反子重组质粒pSE-dhaB-dhaT并在大肠杆菌JM 109中进行表达,在大肠杆菌中构建一条新的产1,3-丙二醇代谢途径。研究表明,重组菌株JM 109/pSE-dhaB-dhaT在微好氧条件下,尝试用廉价的乳糖为诱导物、维生素B12为辅酶,可以将甘油转化为1,3-丙二醇,产量达15.34 g/L,甘油转化率为35.7%,对低成本生产1,3-丙二醇作了有益的探索。     

腺苷钴胺素合成酶基因cobs的克隆及其在产1,3-丙二醇菌中的应用

甘油脱水酶是催化由甘油到1,3-丙二醇过程中的关键酶,它需要在辅酶B_(12)存在的情况下才能有效的进行催化;而在此催化过程中甘油脱水酶会出现失活现象,研究表明辅酶B_(12)可以有效的促使甘油脱水酶复活。因此,辅酶B_(12)在由甘油生物催化生产1,3-丙二醇过程中起到非常重要的作用。本研究利用PCR扩增技术,从Escherichia K-12菌株中扩增出产VB_(12)关键酶—腺苷钴胺素合成酶基因cobs,其序列与NCBI上已经公布的序列比对,同源性为99.6%,将基因cobs与产1,3-丙二醇关键酶基因dhaB、yqhD在Klebsiella pneumoniae中共表达,发酵结果显示重组菌所需额外添加的VB_(12)由原始菌株的0.01 g/L下降到0.004 g/L。     

dhaBCE基因与yqhD基因串联表达载体的构建及其生物转化甘油

将来自于肺炎克雷伯氏杆菌的甘油脱水酶基因插入到质粒pET28(a+) -yqhD的上游,并用SD序列隔开,串联构建重组质粒pET28(a+)dhaBCE-yqhD,转化到大肠杆菌E.coli novablue中进行共表达。结果显示：含有pET28(a+) dhaBCE-yqhD的重组菌在28℃条件下,IPTG诱导16h后,甘油脱水酶和yqhD氧化还原酶的酶活力分别达到35 U/ mg和 82 U/ mg ,而对照组检测不到甘油脱水酶酶活;当甘油浓度为55g/L,产物1,3-PD的产量可达39g/L;甘油浓度过量不利于产物合成,且产物1,3-丙二醇对合成反应具有一定的抑制作用。     

含甘油脱水酶激活因子编码基因的产1,3-丙二醇新型重组菌的构建

利用PCR技术扩增来源于弗氏柠檬杆菌(Citrobacter freundii)的甘油脱水酶编码基因dhaB以及甘油脱水酶激活因子编码基因dhaGdhaF,将其与1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的编码基因yqhD串联在温控表达载体pHsh上,构建重组菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)。SDS-PAGE分析显示,融合表达产物的分子量同核酸序列测定的推导值相符。与未串联甘油脱水酶激活因子编码基因的重组菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-yqhD)相比,1,3-丙二醇的产量提高了28%。     

甲酸脱氢酶在Klebsiella pneumoniae中的表达和功能分析

在甘油厌氧发酵生产1,3-丙二醇的过程中,需要消耗还原当量NADH,NADH的有效供给决定了1,3-丙二醇的产量和得率。采用PCR方法从Candidaboidinii基因组中克隆编码甲酸脱氢酶基因fdh,将fdh基因片段插入载体pMALTM-p2X中,构建表达载体pMALTM-p2X-fdh,并转入1,3-丙二醇生产菌Klebsiella pneumoniae YMU2,获得重组菌Klebsiella pneumoniae F-1。研究了重组质粒的稳定性和IPTG诱导fdh基因过量表达的条件。结果表明,重组质粒具有良好的稳定性;fdh基因表达的蛋白分子量为40.2kDa;IPTG诱导表达研究表明,在IPTG浓度为0.5mmol/L时,诱导4h后甲酸脱氢酶表达明显;发酵过程中甲酸脱氢酶比酶活达到5.47U/mg;与出发菌株K.pneumoniae YMU2相比,重组菌F-1合成1,3-丙二醇的浓度提高了12.5%。     

克雷伯氏肺炎杆菌HR526快速合成1,3-丙二醇发酵特性研究

研究了实验室筛选的一株高产1,3-丙二醇(PDO)菌株克雷伯氏肺炎杆菌HR526(Klebsiella pneumoniae HR526), 在5 L B. Braun发酵罐进行甘油补料流加发酵30 h, PDO达到91.47 g/L, 胞外代谢通量分析显示, PDO在对数中期通量达到最大, 而乳酸在稳定期通量达到最大。结合酶学检测分析了PDO合成关键酶PDO氧化还原酶(PDOR)、甘油脱水酶(GDHt)和甘油脱氢酶(GDH)酶活的变化, PDO氧化还原酶活性在对数中期达到最高, 甘油脱水酶/甘油脱氢酶在对数期远大于稳定期、衰退期, 与代谢通量变化一致甘油脱水酶/甘油脱氢酶活性比例不均衡是3-HPA对数期积累的原因, PDO合成主要集中在对数期, 是生长偶联的代谢产物。     

醛脱氢酶基因敲除的K.pneumoniae重组菌的构建

在利用KlebsiellapneumoniaeM5aL厌氧发酵甘油生产1,3丙二醇的过程中,一部分甘油通过氧化代谢途径经醛脱氢酶(ALDH)催化合成大量副产物乙醇,降低了1,3丙二醇的产量和得率。首次以醛脱氢酶ALDH为改造目标,利用同源重组技术获得了ALDH基因敲除的K.pneumoniae重组菌。首先,采用PCR的方法分别从K.pneumoniaeM5aL基因组DNA及质粒pBR322上扩增得到ALDH基因和四环素抗性基因(Tcr);然后将ALDH基因定向插入到质粒pUC18的多克隆位点得到中间载体pUC18ALDH,该载体与Tcr基因分别用AvaI和BsaAI双酶切后进行连接,得到ALDH基因敲除的重组载体pUCAT;经DNA测序及限制性酶切电泳分析,构建的载体由5′ALDHTcr3′ALDHpUC18组成,与设计结果相符;最后,利用该载体通过同源重组技术得到两株K.pneumoniae重组菌06231hb及06231hc,经菌落PCR及酶活鉴定,两株菌的ALDH基因均已缺失。与出发菌株K.pneumonaieM5aL相比,重组菌的乙醇合成浓度降低了43%～53%,1,3丙二醇合成浓度提高了27%～42%。     

在Klebsiella pneumoniae醛脱氢酶失活菌中构建NADH再生系统

生物法生产1,3-丙二醇（1,3-Propanediol,1,3-PD）是当前工业生物技术研究的热点之一,生产过程中,需要消耗还原当量NADH,NADH的有效供给决定了1,3-PD的产量和得率。本文采用PCR的方法从Candida boidinii基因组中克隆编码fdh的基因,将该基因片段插入载体pMALTM-p2X,构建表达载体pMALTM -p2X-fdh,并转入醛脱氢酶失活菌Klebsiella pneumoniae DA-1HB,获得重组菌Klebsiella pneumoniae DAF-1。在IPTG浓度0.5 mmol/L时,诱导3 h后甲酸脱氢酶表达明显;发酵过程中甲酸脱氢酶比酶活达到4.82 U/mg;与出发菌株K. pneumoniae DA-1HB相比,重组菌DAF-1合成1,3-丙二醇的浓度提高了19.2%?。     

利用甘油发酵耦联生产3-羟基丙酸及1,3-丙二醇重组菌的构建及筛选

在肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)代谢甘油生产1,3-丙二醇(1,3-PD)的过程中,为了减少有毒中间产物3-羟基丙醛(3-HPA)的积累,可将其转化为3-羟基丙酸(3-HP),从而实现1,3-丙二醇和3-羟基丙酸的联产。克隆来自于酿酒酵母的NAD+依赖型的乙醛脱氢酶(ALDH)的基因aldh4,构建了表达载体pKP-aldh,转化K.pneumoniae,得到了有效表达乙醛脱氢酶的重组肺炎克雷伯杆菌(K.pneumoniae A+)。在此基础上,使用紫外诱变联合菌种驯化的方法对K.pneumoniae A+进行筛选,获得了可耐受较高3-HP浓度(≥35 g/L)的重组肺炎克雷伯杆菌K.pneumoniae A+5-3。发酵实验结果表明,K.pneumoniae A+5-3可将3-HPA转化为3-HP,能够同时利用甘油耦联生产3-HP和1,3-PD,产量分别达到5.0 g/L和74.5 g/L。     

产1,3-丙二醇新型重组大肠杆菌的构建

利用PCR技术从大肠杆菌(Escherichia coli )中扩增出1.16 kb的编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD,将其连接到表达载体pEtac,得到重组载体pEtac-yqhD,重组载体在大肠杆菌JM109中得到高效表达。SDS_PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为43 kD,同核酸序列测定所推导的值相符。对含有yqh-D的基因工程菌进行表达研究表明：37 ℃,以1.0 mmol /L IPTG诱导4 h,1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力达到120 u/mg蛋白,而对照菌株的酶活力为0.5 u/mg蛋白。再将含甘油脱水酶基因dhaB和含1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的重组质粒共转化大肠杆菌JM109得到重组大肠杆菌JM109（pUCtac-dhaB, pEtac-yqhD）,该菌株在好氧条件下,以1.0mmol/L IPTG诱导可将50 g/L甘油转化为38.0 g/L 1,3-丙二醇。首次发现1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶在好氧条件下表现出较高的活性。     

产1，3-丙二醇重组大肠杆菌JM109（pEtac—dhaB—tac—yqhD）的构建

在生物柴油的生产过程中,最高可得到约10％的副产物甘油,副产物甘油的去向将成为生物柴油大规模产业化发展所面临的严峻问题。以生物柴油副产物甘油为原料耦合生产1,3-丙二醇,不仅解决了生物柴油副产物甘油的出路问题,同时降低了1,3-丙二醇的生产成本。本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏茵的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用表达载体pEtac串联构建了重组质粒pEtac—dhaB—tac—yqhD,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇重组大肠杆菌JM109（pEtac—dhaB-tac—yqhD）,降低了代谢中间产物3-羟基丙醛的积累,提高了1,3-丙二醇的产量。     

一步法产1,3-丙二醇酿酒酵母基因工程菌的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,发酵法生产1,3-PD是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径。本研究在前期工作的基础上,将分别来源于大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的基因片段yqhD和dhaB串联表达,构建重组表达载体pYX212-zeocin-pGAP-yqhD-pGAP-dhaB;并得到重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303-1A/pYX212-zeocin-pGAP-yqhD-pGAP-dhaB。该重组菌和对照S.cerevisiae分别以葡萄糖为底物摇瓶发酵72h后,重组酿酒酵母发酵液中1,3-PD含量约为1.5g/L;而对照菌株不产1,3-PD。以上结果表明本研究在国内首次成功构建了直接以葡萄糖为底物发酵生产1,3-PD的酿酒酵母基因工程菌。为进一步将dhaB、yqhD基因导入其他以葡萄糖为底物高产甘油的酵母宿主中表达,获得以葡萄糖为底物一步法发酵高产1,3-丙二醇工程菌打下了坚实的基础。     

异源表达木糖异构酶基因对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影响

【目的】提高克雷伯氏菌胞内还原力以强化1,3-丙二醇合成。【方法】将来源于大肠杆菌的木糖异构酶基因在克雷伯氏菌中异源表达,构建重组菌。研究重组菌添加不同浓度木糖为辅底物与甘油共发酵过程中代谢产物和NADH的变化规律。【结果】与对照菌相比,重组菌细胞内还原力NADH提高了0.1?0.3倍,1,3-丙二醇产量达到23.31 g/L,提高20%,1,3-丙二醇转化率从0.60 mol/mol提高到0.73 mol/mol。【结论】木糖异构酶基因的表达强化了木糖代谢途径,经磷酸戊糖途径积累大量还原力,促进了1,3-丙二醇的生成。     

聚羟基丁酸路径在克雷伯氏菌中的构建

以生物柴油的副产物甘油生产高附加值的1,3-丙二醇,现已成为提升生物柴油产业链经济性的重要途径,而中间代谢产物3-羟基丙醛积累造成细胞死亡,发酵异常终止是生物法生产1,3-丙二醇过程中的关键问题。不同于传统的降低3-羟基丙醛积累的思路,本文从增强克雷伯氏菌对3-羟基丙醛的抗逆性出发,改善克雷伯氏菌1,3-丙二醇的生产性能,首次将聚羟基丁酸路径引入克雷伯氏菌中,构建了新型基因工程菌,并对其1,3-丙二醇发酵性能及聚羟基丁酸代谢进行了初步的研究。经IPTG诱导,工程菌中检测到聚羟基丁酸,其含量随IPTG浓度增加而增大。优化的IPTG浓度为0.5 mmol/L。初始甘油50 g/L时,野生菌可正常发酵生产1,3-丙二醇,1,3-丙二醇浓度达到22.1 g/L,其质量得率为46.4%。当初始甘油达到70 g/L时,由于高浓度3-HPA积累,野生菌发酵终止,而工程菌可正常发酵生产1,3-丙二醇,PDO产量可达31.3 g/L,其质量得率为43.9%。同时检测到聚羟基丁酸积累。研究结果有助于加深对克雷伯氏菌1,3-丙二醇代谢机理的认识,为克雷伯氏菌的进一步优化提供了新的思路。     

Expression of 1,3-propanediol oxidoreductase and its isoenzyme in Klebsiella pneumoniae for bioconversion of glycerol into 1,3-propanediol

In the Klebsiella pneumoniae reduction pathway for 1,3-propanediol (1,3-PD) synthesis, glycerol is first dehydrated to 3-hydroxypropionaldehyde (3-HPA) and then reduced to 1,3-PD with NADH consumption. Rapid conversion of 3-HPA to 1,3-PD is one of the ways to improve the yield of 1,3-PD from glycerol and to avoid 3-HPA accumulation, which depends on enzyme activity of the reaction and the amount of reducing equivalents available from the oxidative pathway of glycerol. In the present study, the yqhD gene, encoding 3-propanediol oxidoreductase isoenzyme from Escherichia coli and the dhaT gene, encoding 3-propanediol oxidoreductase from K. pneumoniae were expressed individually and co-expressed in K. pneumoniae using the double tac promoter expression plasmid pEtac-dhaT-tac-yqhD. The three resultant recombinant strains (K. pneumoniae/pEtac-yqhD, K. pneumoniae/pEtac-dhaT, and K. pneumoniae/pEtac-dhaT-tac-yqhD) were used for fermentation studies. Experimental results showed that the peak values for 3-HPA production in broth of the three recombinant strains were less than 25% of that of the parent strain. Expression of dhaT reduced formation of by-products (ethanol and lactic acid) and increased molar yield of 1,3-PD slightly, while expression of yqhD did not enhance molar yield of 1,3-PD, but increased ethanol concentration in broth as NADPH participation in transforming 3-HPA to 1,3-PD allowed more cellular NADH to be used to produce ethanol. Co-expression of both genes therefore decreased by-products and increased the molar yield of 1,3-PD by 11.8%, by catalyzing 3-HPA conversion to 1,3-propanediol using two cofactors (NADH and NADPH). These results have important implications for further studies involving use of YqhD and DhaT for bioconversion of glycerol into 1,3-PD.     

克雷伯氏肺炎杆菌LDH526产1,3-丙二醇的甘油自动流加策略

1,3-丙二醇是一种重要的化工原料,主要作为平台化合物用于合成聚酯,如聚对苯二甲酸丙二醇酯。经基因工程改造的克雷伯氏肺炎杆菌LDH526能以甘油作为唯一碳源合成1,3-丙二醇,最终发酵浓度超过90 g/L。甘油浓度是影响1,3-丙二醇合成的关键因素。为了实现对甘油浓度的精确控制,设计并优化了基于发酵动力学的甘油自动流加策略。通过将底物流加速率与易观察变量p H和发酵时间偶联,实现了发酵过程中甘油流加的自启动和甘油浓度的动态控制。发酵72 h,1,3-丙二醇的浓度可稳定超过95 g/L。自动控制甘油流加的发酵过程具有可重复性、连续性以及人工工作量少的特点,有望从实验室规模扩大到生产规模。     

克雷伯杆菌甘油脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的动力学机制

本研究主要对克雷伯杆菌甘油转化1,3-丙二醇代谢途径中的2个关键酶甘油脱氢酶(GDH)、1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)反应机制和动力学进行了研究。首先,通过初速度和产物抑制动力学研究确定了GDH、PDOR双底物酶促反应机制为有序BiBi机制,明确了由反应物消耗到产物生成之间的历程。其次,建立了GDH、PDOR双底物酶促反应动力学模型,由动力学模型可知,在偶合反应中,如果GDH和PDOR酶量相同,GDH氧化反应成为限速反应,而辅酶I将主要以氧化型NAD+形式存在。动力学信息为酶法合成1,3-丙二醇和代谢工程研究提供理论指导。