重组HIV表面抗原gp120的表达纯化及免疫学鉴定

为研制具有流行特点的HIV血清学诊断试剂,采用pET系统表达HIV-1表面糖蛋白gp120。研究发现,全长的gp120在E.coli中不能有效表达;N端半长的gp120可以表达,但表达量很低;仅保留N端1/3的gp120(包含gp120V1/V2抗原决定簇)有效表达,表达蛋白占菌体总蛋白的18%;Westernblot显示较好的反应原性;通过金属螯合层析,产物得到完全纯化。在这些结果的基础上,我们表达了流行株的gp120片段,为探索gp120在大肠杆菌的高效表达,建立针对中国人群的HIV血清学诊断系统奠定基础。     

HIV-1 CRF07 B/C亚型gp41的表达、纯化和初步结构分析

HIV-1跨膜蛋白gp41是HIV-1包膜与靶细胞膜融合过程中的关键蛋白,而且序列保守,是理想的HIV-1作用靶点。为获得HIV-1中国流行株CRF07 B/C gp41蛋白的晶体结构来指导疫苗设计及药物开发,采用CRF07 B/C gp160基因序列为模板,经PCR、酶切、连接,将gp41 helix-bundle区域克隆到pET30-his表达载体中,经表达、纯化和结晶筛选,获得了gp41 helix-bundle的晶体并解析了结构,为针对中国艾滋病病毒流行株疫苗的设计及药物开发提供了结构参考。     

共表达HIV-1中国流行株gp120与IL-18重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性观察

为筛选我国的HIV-1疫苗候选株,以鸡痘病毒282E4中国疫苗株为载体,构建了共表达中国流行株HIV-1外膜蛋白gp120和IL-18的重组鸡痘病毒,并将该重组鸡痘病毒免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平。结果显示,HIV_1外膜蛋白gp120和IL-18不但可在重组鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞中表达,而且可在重组鸡痘病毒感染的哺乳动物细胞中表达。重组病毒具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生特异性抗体和脾特异性CTL反应,且IL_18发挥了免疫佐剂的作用。本研究结果为制备安全、有效的HIV-1基因工程活载体疫苗奠定了基础。     

重组HIV表面抗原gp120的表达纯化及免疫学鉴定

为研制具有流行特点的HIV血清学诊断试剂,采用pET系统表达HIV－1表达糖蛋白gp120。研究发现,全长的gp120在E.coli中不能有效表达;N端半长的gp120可以表达,但表达量很低;仅保留N端1／3的gp120（包含gp120V1／V2抗决定簇）有效表达,表达蛋白占菌体总蛋白的18％;Western blot显示较好的反应原性;通过金属螯合层析,产物得到完全纯化。在这些结果的基础上,我们表达了流行株的gp120片段,为探索gp120在大肠杆菌的高效表达,建立针对中国人群的HIV血清学诊断系统奠定基础。     

HIV-1 C亚型密码子优化gp120基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建含有HIV-1C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并在293细胞中表达gp120蛋白。方法PCR扩增,获得HIV-1C亚型gp120片段,定向克隆人腺病毒转移载体pTrack-CMV,线性化后转化至含有腺病毒骨架载体pAd-easy-1的大肠埃希菌BJ5183,获得重组子prAd—gp120,PacI酶切纯化后转染293细胞,包装成复制缺陷型重组腺病毒vAd—gp120。结果经PCR、酶切及DNA测序,插入片段大小、方向正确,获得了具有感染力的vAd—gp120重组腺病毒;通过Western印迹检测,重组腺病毒在293细胞中表达出分子量为120kD的蛋白。结论成功构建了含有HIV-1C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并获得该基因的表达。     

HIV-1包膜蛋白gp41优势抗原的构建及可溶性表达

目的:筛选1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)中国流行株中包膜蛋白gp41的优势抗原片段,构建具有区域流行代表性的HIV-1 gp41重组抗原,为改进现有HIV-1初筛试剂盒中使用的同类抗原奠定基础。方法:利用免疫斑点杂交和生物信息学方法,从收集自重庆、广州、上海的区域代表性150份HIV-1感染者血清标本中筛选gp41抗原性强的候选样本,利用RT-PCR及巢式PCR方法扩增包含重要抗原表位决定蔟的gp41基因片段,与原核表达载体pQE30连接,转化大肠杆菌M15构建gp41重组抗原表达菌株,表达后经亲和层析纯化、SDS-PAGE和Western印迹鉴定。结果:兔源HRP标记的gp41多抗能识别标本中gp41抗原性差异,得到候选样本,扩增包含gp41主要抗原表位片段;构建了包含gp41抗原表达簇的重组原核表达质粒,表达、纯化后经His标签抗体Western印迹鉴定为阳性。结论:高纯度的重组优势gp41抗原的构建和鉴定,为进一步改进现有HIV初筛诊断奠定了基础。     

HIV包膜蛋白Gp120在果蝇Schneider 2细胞内的表达纯化及初步性质鉴定

构建pMT/BiP/V5-HisA-HIVgp120真核表达载体,通过稳定转染获得稳定表达gp120蛋白的果蝇Schnei-der2(S2)细胞系,并对gp120蛋白进行大量表达和纯化。应用聚合酶链式反应技术从重组载体PVR1012-gp120中扩增出中国流行株CRF07-BCgp120全长基因后,将其插入载体pMT/BiP/V5-HisA。应用脂质体转染技术将真核表达载体和抗性筛选质粒共转染果蝇S2细胞,通过杀稻瘟菌素反复筛选,建立稳定高表达gp120蛋白的果蝇S2细胞系,并通过镍柱亲和层析和分子筛法纯化目的蛋白。用SDS-PAGE对重组蛋白的分子量和纯度进行分析,并通过Western blot和酶联免疫吸附技术(ELISA)对其进行鉴定。成功构建了gp120真核表达载体并获得了稳定转染该蛋白的果蝇S2细胞系,成功的表达了具有良好抗体反应性的gp120全长蛋白。此结果为深入研究HIV包膜蛋白gp120的生物学特性及进行HIV疫苗的研究提供了良好的物质基础。     

重组HIV-1 gp120 AAV2/1在小鼠和恒河猴体内的免疫原性

本文旨在研究表达HIV-1中国流行株gp120基因的重组腺相关病毒疫苗在小鼠和恒河猴体内的免疫原性。用rAAV2/1-gp120免疫BALB/c小鼠和恒河猴,分别用ELISA和HIV-1假病毒中和试验检测免疫动物血清中HIV-1特异性IgG抗体水平和中和抗体水平,用ELISPOT方法和体内杀伤实验检测HIV-1特异性细胞免疫应答水平。结果显示在小鼠体内用rAAV2/1-gp120仅免疫一次就能诱导较高水平的IgG抗体,IgG抗体至少能持续21周,但没有检测到中和抗体。rAAV2/1-gp120在小鼠体内诱导微弱水平的HIV-1特异性细胞免疫应答。rAAV2/1-gp120在恒河猴体内诱导的HIV-1特异性细胞和抗体反应均很弱,且检测不到中和抗体。提示rAAV2/1载体在诱导抗体反应方面具有特殊优势,但若希望诱导HIV-1特异性中和抗体,则需要改造env基因以提高其免疫原性。     

表达HIV-1 CRF01＿AE亚型结构基因小鼠模型的建立和鉴定

目的:构建并鉴定表达HIV-1 CRF01_AE亚型结构基因的小鼠模型。方法:使用哺乳动物密码子优化的HIV-1 CRF01_AE gp160基因,通过慢病毒包装系统构建重组慢病毒LV-GFP-AE gp160,将上述重组慢病毒感染小鼠肺上皮细胞TC-1,经嘌呤霉素抗性筛选获得稳定表达gp160基因的TC-1细胞。采用RT-PCR、流式细胞术检测gp160基因在细胞内的表达稳定性,将稳定表达Gp160蛋白的TC-1-HIV AE gp160细胞接种小鼠,用免疫组化方法检测小鼠体内细胞团块中HIV Gp160蛋白的表达。结果:菌落PCR、酶切鉴定和测序表明重组质粒pLVX-AE gp160构建正确,RT-PCR、GFP荧光及流式细胞术结果均显示gp160基因能在细胞TC-1中稳定表达,免疫组化结果也表明小鼠体内接种的细胞可以稳定表达HIV Gp160蛋白。结论:建立了稳定表达HIV-1 CRF01_AE亚型Gp160蛋白的TC-1细胞及小鼠模型,为HIV-1 CRF01_AE亚型HIV疫苗的临床前研究提供了可靠的体外、体内免疫原性评价工具,为该疫苗的进一步开发奠定了坚实的实验基础。     

DC-SIGN蛋白在家蚕系统中的表达及生物活性研究

目的：构建人DC-SIGN基因片段的家蚕表达系统,进行目的产物表达、鉴定及生物活性分析。方法：从体外刺激分化的DC细胞中克隆出DC-SIGN cDNA,在家蚕表达载体pBacPAK8的BamHⅠ和EcoRⅠ位点构建成重组质粒pBacPAK8-DC-SIGN,与线性化的Bm-BacPAK6病毒基因组DNA共转染家蚕细胞,空斑筛选得到重组病毒Bm-BacPAK-DC-SIGN,重组病毒感染家蚕细胞BmN,Western blot检测表达产物;HIV-1包膜糖蛋白gp120与表达产物孵育检测其生物活性。结果：构建了稳定表达人DC-SIGN蛋白片段的家蚕杆状病毒表达系统;成功表达了DC-SIGN蛋白片段,且能特异性地与HIV-1包膜糖蛋白gp120结合。结论：成功地在家蚕杆状病毒表达系统中表达了人DC-SIGN蛋白片段,具有天然DC-SIGN蛋白样的生物活性,为其抗体制备及AIDS防治药物的研发奠定了基础。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.