大肠杆菌F18菌毛及其亚型的PCR鉴定

F18菌毛是产肠毒素大肠杆菌 (ETEC)与产vero细胞毒素大肠杆菌 (VTEC)的重要致病因子 ,可介导细菌对小肠细胞的黏附 ,并具有F18ab和F18ac 2个抗原亚型。根据已发表的F18ab菌毛A亚单位 (FedA ab)的基因 (fedA ab)设计 3条引物 ,建立了 2种聚合酶链式反应 (PCR)扩增方法。通过对F18ab 大肠杆菌、F18ac 大肠杆菌、K88 大肠杆菌、K99 大肠杆菌、987P 大肠杆菌、F4 1 大肠杆菌的试验 ,结果表明所建立的PCR方法可特异性鉴定F18 大肠杆菌并区别其亚型F18ab与F18ac     

鸡大肠杆菌病病原的分离鉴定和部分生物学特性研究

无菌采取某鸡场送检的疑似大肠杆菌病的病、死鸡的心血、肝、脾、肾,进行病原菌的分离、生化鉴定、动物实验和药敏试验。生化鉴定结果显示引起该鸡场鸡只发病的病原为大肠杆菌,并且该菌对小白鼠和鸡有较强的致病力。药物敏感性试验结果显示,该菌对先锋V、头孢呋肟、头孢噻肟敏感,对庆大霉素和氧氟沙星不敏感,而链霉素、新诺明、红霉素、青霉素、氨苄西林、四环素对它完全没有抑制效果。结果表明:该鸡场出现了耐药的致病性大肠杆菌,在以后的肉鸡生产中应慎用抗生素,在使用药物治疗大肠杆菌病时,应根据药敏试验结果,选择敏感药物,且应注意交替用药,按疗程投药。     

猪源大肠杆菌Nissle 1917菌株的分离鉴定

【目的】证实大肠杆菌Nissle 1917作为自然菌株存在于动物猪体内,并能从猪粪便中分离。建立大肠杆菌Nissle 1917的原位杂交鉴定方法。【方法】采集135份健康断奶仔猪的新鲜粪便制备DNA模板,以人源大肠杆菌Nissle 1917为阳性对照菌株,分别针对Nissle 1917的I型菌毛亚单位Fim A、F1C菌毛亚单位Foc A及两个质粒pMUT1和pMUT2的相关基因序列设计5对特异性引物进行PCR扩增;并将其中427 bp大小的质粒片段pMUT2(a)作为目的片段回收纯化,用地高辛随机引物标记法制成DNA探针。【结果】从其中的2份DNA模板中扩增出上述5对特异性引物PCR预期大小相符的片段,初步认为大肠杆菌Nissle 1917可能存在于猪体内。应用制备的探针通过菌落原位杂交的方法从2份阳性粪便样品中筛选出2株阳性菌落,通过血清学检验、PCR扩增和测序进一步鉴定为阳性Nissle 1917菌株。【结论】动物源益生菌Nissle 1917的分离鉴定,为优良动物源益生菌研究和应用奠定了基础。     

利用ERIC-PCR对苏云金芽胞杆菌与蜡状芽胞杆菌进行鉴定的研究

为了探索ERIC-PCR技术在苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌的鉴定及分型中的应用价值,本研究采用PCR方法初步检测苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的组成,并对苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌的总DNA进行ERIC-PCR扩增,分析ERIC-PCR指纹图谱的特点并采用NTSYS2.10软件对其进行聚类。结果显示,各菌株的ERIC指纹图谱表现出不同程度的多态性,但图谱与菌株所含cry基因的类型存在一定的相关性。聚类分析结果显示,含有相同或相近cry基因类型的Bt菌株在进化树上趋向聚为一类,而不含cry基因的蜡状芽胞杆菌趋向于与不含cry基因的Bt菌株聚为一类或单独聚类。若在多种模式菌株的参考下,该方法可用于苏云金芽胞杆菌的初步鉴定和分型。     

牦牛肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定和某些生物学特性的研究

从西藏地区腹泻死亡牦牛中分离出 1株肠毒素型大肠杆菌并对其某些生物学特性进行了研究。结果表明 ,该菌在形态特征、培养特性和生化特性方面与大肠杆菌基本一致。血清学试验表明 ,该菌株O抗原属O14 8,K88,K99,987P单因子血清均不能凝集本菌 ;该菌不产生溶血素 ;对绵羊、豚鼠、马、鸡的红细胞表现强凝集 ,而K88,K99,987P抗血清均不能抑制其对绵羊、豚鼠、马、鸡红细胞的凝集 ;该菌株在营养肉汤中经 37℃ ,4 8h培养表达菌毛 ;肌肉接种兔、腹腔接种小白鼠均具有高致病性 ;乳鼠胃内投服试验和兔回肠结扎试验证明 ,该菌能产生热稳定肠毒素和热敏性肠毒素 ;分离菌株对恩诺沙星、环丙沙星、阿莫西林、羧苄青霉素等高度敏感 ,而对链霉素、四环素、土霉素等表现耐药性。     

禽病原性大肠杆菌1型菌毛的分离与鉴定

以旋涡混合法使禽病原性大肠杆菌分离株566、1794和TK3菌毛脱落,经硫酸铵沉淀、透析后进行蔗糖密度梯度离心,收集密度为110至115g/cm3的蛋白带,经SDSPAGE测定,3株菌菌毛蛋白的分子量分别在175、170和170kD;提纯菌毛保留了甘露糖敏感性凝集豚鼠红细胞的能力,证明它们为1型菌毛;从1794株提取的1型菌毛免疫BALB/C小鼠产生的高免血清在Western blot中与3个菌株的相应菌毛蛋白均呈阳性反应。上述结果表明,受检的3株禽病原性大肠杆菌均表达了1型菌毛,其分子量在175～170kD之间,3个菌株的1型菌毛间具有较强的抗原相关性。     

肠出血性大肠杆菌转移紧密黏附素受体的表达及其活性鉴定

目的:在原核表达基因工程茵中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7转移紧密黏附素受体(Translocated Intimin Receptor,Tit)蛋白的高效表达,并对其活性进行初步鉴定.方法:采用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中调取tir基因,插入pEASY-T1 克隆栽体.克隆质粒测序鉴定后,采用Nde Ⅰ、Xho Ⅰ限制性核酸内切酶双酶切pEASY-Tl-tit质粒获得tir基因,连接同样经过双酶切的pET-22b(+).表达质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测相对分子质量,Western blotting验证抗原活性.荧光显微镜观察蛋白是否具有嵌入细胞膜的活性.结果:PCR扩增得到1686bp的目的片段.构建的原核表达质粒pET-22b(+)-tir经酶切鉴定及测序与预期序列一致.目的蛋白以裂解上清形式表达,表达量约3mg/ml.经镍柱纯化后纯度达90%以上.重组表达的Tir具有嵌入细胞膜的生物学功能.结论:成功表达了具有生物活性的重组Tir蛋白,为Tir的功能研究奠定基础.     

苏北地区规模化猪场产肠毒素大肠杆菌的分离鉴定及灭活疫苗效果评估

[目的]产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起仔猪腹泻的重要病原菌,本研究通过调查苏北地区规模化猪场ETEC的流行情况,分析其生物学特性,研制具有免疫保护效果的优势血清型菌株的灭活疫苗,以期对苏北地区ETEC的防控提供参考。[方法]从苏北地区规模化猪场采集3-30日龄的仔猪新鲜粪样、肛拭子及小肠组织样,分离出ETEC,对分离菌株进行血清型鉴定、耐药性测定、小鼠致病力测定;最后通过动物免疫试验研究优势血清型菌株灭活疫苗对小鼠的免疫保护效果。[结果]从21个规模化猪场采集病料562份,通过PCR鉴定及测序得到141株ETEC;血清凝集试验鉴定出85株菌的O抗原血清型,其中08、0101和0128为优势血清型,占定型菌株的61.2%(52/85),其他血清型包括09、03、020、0148、0149等;分析141株ETEC对14种常见抗生素的耐药情况,得出分离株对新霉素、红霉素、四环素、庆大霉素、强力霉素、阿莫西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑高度耐药,耐药率均高达80%以上;对恩诺沙星敏感性较高,敏感率达50.4%(71/141);对多粘菌素B和头孢噻肟中介耐药,占比分别为66%(93/141)和51.8%(73/141);多重耐药现象严重,其中10重耐药的菌株占比最大,为19%(27/141);小鼠攻毒试验测得08血清型强毒株YC-6的半数致死量(median lethal dose,LD50)为1.4×10^7 CFU/只,最低致死量(minimum lethal dose,MLD)为3×10^7 CFU/只;08血清型强毒株YC-6和0101血清型强毒株LYG-3制备的单价灭活疫苗对小鼠的保护率均达到100%,因此利用08血清型强毒株YC-6和0101血清型强毒株LYG-3研制二价灭活疫苗,结果显示该二价疫苗对感染不同血清型ETEC小鼠的保护率在83%以上。[结论]本研究通过对苏北地区ETEC的流行病学调查,得出其优势血清型,并研制出针对对优势血清型免疫保护效果较好的二价灭活疫苗,给临床ETEC的监测和防控提供参考。     

一株高锰氧化活性大肠杆菌的分离鉴定和多铜氧化酶基因的克隆与结构特性

锰氧化物是Mn(Ⅱ)经生物和化学氧化后形成的矿物成分,在元素生物地球化学循环过程中起着重要作用,而不同种类的细菌对Mn(Ⅱ)的氧化作用是自然界中氧化锰矿物形成的主要成因.从山东崅峪采集的铁锰结核棕壤中分离得到一株具有高锰氧化活性的土壤杆菌,其对Mn(Ⅱ)的氧化作用活性明显高于其它分离菌株,达到65 μmol/L.通过个...     

白羽鸡致病性大肠杆菌、沙门氏菌的分离鉴定及抗生素耐受性分析

【背景】大肠杆菌、沙门氏菌是肉鸡养殖中的主要致病菌,可造成巨大的经济损失,其耐药情况不容忽视。【目的】从病死鸡体内分离致病性大肠杆菌、沙门氏菌并对其进行鉴定,分析其耐药特性。【方法】常规方法分离纯化目标菌株,结合生化试验、16S rRNA基因序列分析、生长曲线验证进行鉴定,采用纸片扩散法进行药敏试验,分析其耐药率及多重耐药性。【结果】共分离得到10株大肠杆菌和10株沙门氏菌(包括4株肠道亚种、1株亚利桑那亚种和5株邦戈尔沙门氏菌种);大肠杆菌仅对碳青霉烯类药物敏感,对其他类药物耐药性较强;沙门氏菌对碳青霉烯类药物敏感,对其他类药物则呈现不同程度的耐药性;所有分离菌均为多重耐药菌。【结论】分离得到了病原菌并确定了其耐药特性,为白羽鸡养殖中大肠杆菌、沙门氏菌的防治提供了参考。     

环境对产毒性大肠杆菌肠毒素表达的影响

通过体外试验,探讨一些与人体肠道微环境有关因素的变化对ＥＴＥＣ主要毒力因子肠毒素产生的影响。研究结果表明,细菌培养基的ｐＨ、渗透浓度、气体组成及温度的不同均可影响ＥＴＥＣ肠毒素的产生,而且ＬＴ与ＳＴ对有关环境因素的反应有所不同,一些与肠道环境有关环境条件的变化可影响ＥＴＥＣ肠毒素的表达,提示机体肠道微环境的变化可能与ＥＴＥＣ的致病有关。     

大肠杆菌K12不同生长时期培养液和溶浆对其生长的影响

最近的研究中发现细菌中也存在类似多细胞生物的细胞与细胞的信息交流(如群体感应)。本实验提取了大肠杆菌不同生长时期的培养液和菌体经超声波破碎后得到的溶浆,发现它们可使其自身迟缓期缩短,生长加快,而且不同时期的培养液和溶浆对其生长的影响不同。这可能与存在于细菌中的相互作用有关。     

淋球菌nspA和大肠杆菌ltB融合基因的构建、表达及鉴定

通过基因工程的方法构建奈瑟氏淋球菌表面蛋白A(Neisseria gonorrhoeae surface protein A,nspA)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin,ltB)融合基因的原核表达载体,对其进行表达与鉴定,为后续融合蛋白LTB-NspA的生物活性分析及其作为淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定基础。用PCR法从标准菌株分别扩增出nspA、ltB基因,用重组PCR法通过接头将ltB与nspA融合,将其插入pEG30a中,转入BL21中表达。经测序、SDS-PAGE和Western blot分析,证实成功构建了ltB-nspA融合基因的原核表达载体,并在BL21中表达。ltB-nspA融合基因的成功表达,为进一步研究其生物活性及淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定了一定基础。     

模拟失重环境对大肠杆菌K12表型异质性亚群菌株的影响

【背景】我国未来几年深空探索任务将呈\"井喷式\"发展,微生物对于航天活动的影响越来越引起关注,而国内外少有表型异质性亚群的研究。【目的】从表型异质性的角度探讨低剪切力模拟失重环境(Low-shearmodeledmicrogravity,LSMMG)和低剪切力正常重力环境(Low-shearnormalgravity,LSNG)对大肠杆菌K12造成的影响。【方法】利用旋转细胞培养系统模拟失重环境对大肠杆菌K12进行连续传代培养,从单克隆形态、颜色以及菌体形态等方面挑选出表型异质性的亚群菌株,对不同菌株进行增殖速率、抗生素耐药性、生物被膜形成、环境压力抵抗力以及细胞毒性的测定,以此评估低剪切力和模拟失重环境对大肠杆菌K12的影响。【结果】利用旋转细胞培养系统连续传代培养,总共分离出4株形态不同的表型异质性亚群菌株,其中2株来自模拟失重组(M1,Ma),另外2株来自正常重力对照组(N1,Na);4株亚群与原始菌株(P)相比,在增殖速率、生物被膜形成、环境压力抵抗力和细胞毒性方面均有增强或减弱的明显变化,对于抗生素的耐药性无明显变化。【结论】低剪切力模拟失重环境以及存在低剪切力的正常重力环境均能引起大肠杆菌表型异质性变化,与原始菌株相比,表型异质性亚群菌株在分化上并没有统一的方向,但仍需警惕那些可能对人类造成危害的变化表型。     

环介导恒温扩增对莱姆病病原伯氏疏螺旋体的分型鉴定

使用环介导恒温扩增技术,基于莱姆病病原伯氏疏螺旋体的外膜蛋白A(OspA)基因,针对伯氏疏螺旋体不同的基因型设计特异性引物,对国内主要的莱姆病病原伯氏疏螺旋体的3个基因型进行分型鉴定。研究结果表明,设计的引物具有良好的特异性,可以对狭义伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensu strict)、嘎氏疏螺旋体(B.afzelii)和伽氏疏螺旋体(B.garinii)进行分型鉴定。伯氏疏螺旋体的分型鉴定可以对不同临床症状莱姆病患者的治疗和莱姆病的控制提供一定的依据。     

禽鱼共养对淡水鲈鱼养殖环境耐药基因传播的影响及机制

为评估单一与混合(禽鱼共养)淡水鲈鱼养殖模式中细菌耐药性及耐药基因传播特征,本研究采集2种养殖模式的沉积物、水、鱼体及鸡粪样本,分离鉴定得到243株菌,通过K-B药敏实验、PCR检测耐药基因和整合子、抗生素压力下的接合转移实验,系统比较2种模式的耐药性特征及传播机制。结果显示,禽鱼共养模式分离菌株有11种抗生素的耐药率显著高于单一养殖模式,所有样品中鸡粪便耐药情况最严重,且禽鱼共养多重耐药菌株占比更高。耐药基因检测显示,禽鱼共养模式检出17种耐药基因,单一养殖模式检出15种耐药基因,禽鱼共养模式中有11个耐药基因的检出率显著高于单一模式。整合子分析表明,禽鱼共养模式3类整合子检出率均高于单一模式,共现网络分析显示其与喹诺酮类、磺胺类耐药基因存在共现关系。接合转移实验证实,禽鱼共养模式分离株的sul1基因转移频率高于单一模式,且磺胺间甲氧嘧啶的亚抑菌浓度能提高接合转移频率。综上所述,禽鱼混合养殖模式加剧了耐药基因的富集与传播,建议加强对混合养殖模式的监管,以降低耐药性扩散风险。     

特异性卵黄抗体(IgY)对小鼠大肠杆菌败血症的保护作用

目的:研究特异性IgY对小鼠大肠杆菌败血症的保护作用.方法:以灭活的E.coli O111免疫产蛋母鸡,抗体经水稀释及盐析分离纯化.ELISA法检测大肠杆菌特异性IgY对大肠杆菌及LPS的结合活性.腹腔注射E.coli O111(1011cfu/mL)建立小鼠败血症模型,攻毒剂量为0.1mL/10g体重.小鼠随机分为5组,分别给药保护:空白组(生理盐水)、阴性对照组(非特异性IgY,20mg/mL)、阳性对照组(头孢哌酮20mg/mL)、高剂量组(特异性IgY,40mg/mL),低剂量组(特异性IgY,20mg/mL).给药剂量为:攻毒前,0.15mL/10g体重,每天一次,共两天;攻毒后,0.25mL/10g体重,每天一次,共七天.观察小鼠临床表现、体重变化、白细胞(WBC)和血小板(PLT)数变化及各组小鼠的死亡率.结果:特异性IgY与E.coli O111和LPS均有体外结合活性.大肠杆菌攻毒后,小鼠体重下降,各组小鼠外周血中WBC和PLT数均有不同程度的下降.特异性IgY保护组各项指标较快恢复到正常水平,其他组恢复缓慢.各组小鼠七天内的死亡率分别为:空白组与阴性对照组都为100%;阳性对照组60%;低剂量IgY组30%;高剂量IgY组10%.结论:特异性IgY对小鼠大肠杆菌败血症有保护作用.