两种藻胆蛋白对人肝癌SMMC-7721细胞的光动力体外杀伤效应

用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测定提取自条斑紫菜的R-藻红蛋白(R-PE)和C-藻蓝蛋白(C-PC)经激光介导对人肝癌SMMC-7721细胞的杀伤率,并检测细胞凋亡率。结果显示在120mg/L浓度下,R-PE在氩离子激光器100J/cm2辐照下对应的细胞存活率为27%,C-PC在He-Ne激光器35J/cm2辐照下对应的细胞存活率为47%;单用2种激光器辐照对应的细胞存活率分别为65%和70%;单用2种蛋白处理细胞在72h后出现对细胞生长的显著抑制,最大抑制率分别为31%(R-PE,120mg/L)和27%(C-PC,250mg/L)。120mg/L的2种藻胆蛋白在对应激光辐照下,于照后8h达到细胞凋亡率最大值,分别为31.54%(R-PE)和32.54%(C-PC)。本实验证明条斑紫菜R-PE和C-PC具有可开发成为光敏剂的应用前景。     

硫酸铵三步盐析对藻胆蛋白纯化的影响

主要研究了多次硫酸铵盐析对条斑紫菜藻胆蛋白提取纯化效果。对分离提取的对条斑紫菜藻胆蛋白溶液进行了3次硫酸氨溶液盐析,实验结果表明:55%饱和度可以将绝大部分藻胆蛋白盐析;采用不同组合(15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%7个饱和度分别与50%、55%、60%3个饱和度两两组合)二步硫酸铵盐析沉淀藻胆蛋白,使R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白的盐析后纯度(A564/A280)分别达到了1.0和0.45以上,得率分别为1.4%和0.95%;第3次硫酸铵盐析使R-藻红蛋白、C-藻蓝蛋白的纯度分别达到了1.4和0.4以上,最终产率分别为1.3%和0.8%,而变藻蓝蛋白产率有所下降(从0.65%到0.49%),但纯度变化不大。实验证明了采用多次盐析方法可以很大程度提高藻胆蛋白纯度。     

条斑紫菜R-藻红蛋白提纯工艺研究

对条斑紫菜叶状体R-藻红蛋白提纯方法进行了研究和分析。首先分别采用冻融法、化学试剂法、溶胀法等单一及组合细胞破碎方法对条斑紫菜细胞进行破碎,结果表明溶胀 组织捣碎法效果最佳。其次用25%～60%饱和度范围内的硫酸铵沉淀法粗提藻红蛋白,发现25%～45%硫酸铵分步沉淀法效果最好,再经结晶法盐析纯度(D565nm/D280nm)达到2.088。盐析液用SephadexG-25层析柱脱盐,再经羟基磷灰石(HA)柱层析,纯度可达到4.98。R-藻红蛋白的最大吸收峰在565nm,其室温荧光发射峰为578nm。SDS-PAGE结果显示,R-藻红蛋白可分为α、β两个亚基,Mr分别为17.0×103和19.0×103。     

条斑紫菜藻红、藻蓝蛋白逐级放大的纯化工艺

采用“破碎-盐析-层析”的方法纯化条斑紫菜藻胆蛋白,并在提取规模上逐步放大。首先在综合比较凝胶层析去盐效率后,从Sephadex G-25、G-100、S-300和CL-6B中选择G-25作为实验流程中的去盐填料,其次将提取流程的初试原料条斑紫菜量逐步放大,选取了1g、20g和400g三个量,结果表明随着初试紫菜量逐步放大,最终所得藻胆蛋白中吸收光谱纯度>3.2的蛋白产率依次提高,其中400g冻干紫菜的藻红蛋白产率为0.323％,藻蓝蛋白产率为0.148％。由此认为该实验工艺流程具有规模放大的潜力,这为高纯度藻胆蛋白的规模生产提供了一条可行的方案。     

条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针制备条件优化

通过化学方法使条斑紫菜R-藻红蛋白与抗体进行交联以制备荧光探针, 并对制备条件进行优化。首先采用异双功能试剂SPDP (N-琥珀酰亚氨基-3-2-吡啶基二硫丙酸醇)和DTT（二硫苏糖醇）分别使 R-PE(R-藻红蛋白)衍生化、IgG（单克隆抗体）巯基化, 其次测定了SPDP与R-PE不同摩尔比对R-PE衍生化的影响、DTT与IgG不同摩尔比对IgG巯基化的影响, 结果表明：SPDP与R-PE的最佳摩尔比为40：1, DTT与IgG的最佳摩尔比为500:1。在此基础上, 建立了R-PE与IgG交联的制备技术, 并应用全波长扫描吸收光谱、电泳分析和荧光显微镜观察等监测和分析技术, 证实了藻红蛋白与抗体已成功交联形成了复合物。     

藻胆蛋白色素肽与癌光啉光敏作用的比较实验

目的：比较藻胆蛋白色素肽与癌光啉photofrinⅡ的光动力学疗法（photodynamic therapy,PDT）效果与日光光敏作用.方法：分析藻胆蛋白酶解产物藻红蛋白R-PE β亚基、藻蓝蛋白的CCP1、CCP3片段与photofrinⅡ的光谱特性,用MTT等方法检测其对小鼠S180细胞、小鼠移植瘤的PDT杀伤作用及对小鼠骨髓细胞、水蚤的日光光毒性.结果：photofrinⅡ在250 nm-650 nm区间有多个吸收峰,在紫外光区有很强的吸收峰,而三种蛋白酶解产物的光谱较单一,其中R-PE β亚基、CCP1在可见光区有1～2较强的吸收峰;当光敏剂在瘤体旁注射量为50μg/个（瘤体）,He-Ne激光照射剂量为120 J/cm^2,瘤体大小在直径为0.5 cm～0.7 cm,phofofrinⅡ、CCP1、CCP3在照射后7天的抑瘤率分别为61%、46%及81%;用广谱性碘钨灯为光源,当光敏剂的浓度为100μg/mL,光照剂量为45 J/cm^2,photofrinⅡ对小鼠S180细胞及骨髓细胞的光敏杀伤作用分别为20%及33%,而RPE β亚基则分别为68%及95%;如果用100μg/mL的CCP1、CCP3、photofrinⅡ及不同照射剂量的碘钨灯为激发光源处理水蚤,结果发现,光毒性对水蚤生存率长短的影响具时间积累效应,在相同光照强度条件下,photofrinⅡ的光毒性最大,CCP3次之,CCP1最弱.结论：藻胆蛋白酶解产物R-PE β亚基、CCP1、CCP3光谱单一、PDT作用效果良好、毒副作用弱且具一定的荧光活性可作为新一代光敏剂选择的对象.     

三种藻胆蛋白在复合累积LB膜中的能量传递

制备了R-藻红蛋白(R-PE)、C-藻蓝蛋白(C-PC)及变藻蓝蛋白(APC)的单组分累积LB膜及三组分复合累积LB膜. 吸收及荧光光谱测定表明三种蛋白的LB膜的光谱重叠性质与他们在水溶液中的性质相同. 结构测定表明, 三种蛋白在其LB膜中排列有序, 且由它们组装的复合累积LB膜结构类似于藻类植物中的藻胆体结构. 通过稳态荧光光谱及其光谱解叠, 观察到了三种蛋白在复合累积LB膜中的激发能量传递现象. 根据给体荧光峰的猝灭, 计算出在复合累积LB膜中从给体R-PE经C-PC到受体APC的能量传递效率为51%.     

环境因子及藻体密度对条斑紫菜生长与氮磷去除效率的影响

以条斑紫菜为材料,系统探究实验室条件下光照强度、温度、光周期、盐度和干出等生态因子和藻体密度对条斑紫菜生长和氮磷去除的影响,为今后条斑紫菜大规模栽培的生态修复潜力研究及海洋富营养化治理奠定理论基础。实验室条件下不同藻体密度、光照强度、光周期、温度、盐度和干出时间对条斑紫菜生长及氮磷去除效率的影响。结果表明:条斑紫菜在藻体密度0.1 g/L、光照强度为120μmol m-2s-1时特定生长率最大,为38.1%。随着藻体密度增加,光照强度减小,其特定生长率逐渐减小,当藻体密度为1.6 g/L、光照强度为30μmol m-2s-1时,特定生长率最小为12.6%;藻体密度0.1—0.8 g/L时随着藻体密度的增加条斑紫菜对NO-3-N和PO3-4-P的去除效率显著增加,藻体密度为0.8—1.6 g/L时藻体对NO-3-N和PO3-4-P去除效率差异不大,其中藻体密度1.6 g/L、光照强度90μmol m-2s-1时条斑紫菜对NO-3-N和PO3-4-P去除效率均达到93%以上。为进一步探究其他环境因子的影响,因此在温度和光周期实验中选择氮磷去除率适中的藻体密度0.4 g/L和最适光照强度90μmol m-2s-1。温度为15℃、光周期为16L∶8D条件下条斑紫菜特定生长率最大,为36.9%,且氮和磷去除效率也最大,分别为91.9%和81.6%。条斑紫菜生长适宜盐度为10—35,最佳盐度为25,干出时间越长生长越慢,氮磷去效率也越低,且有较大交互作用,但干出后的紫菜光合作用更强。以上研究将为应用大型海藻条斑紫菜大规模栽培进行生态修复奠定基础。     

藻胆蛋白复合物的合成及其分子内能量传递

通过偶联剂3-(2-吡啶联巯基)丙酸N-羟基琥珀亚胺酯(SPDP)及改变配料比, 合成了两个R-藻红蛋白(R-PE)与C-藻蓝蛋白(C-PC)的复合物A和B.利用吸收光谱确定了分子内R-PE与C-PC的摩尔比为6∶1和2∶1. 通过荧光光谱, 观察到能量传递现象, 并计算出能量传递效率为63%和88%.证明分子内能量传递效率很高. 二硫苏糖醇(DTT)还原连接R-PE与C-PC的二硫桥键后, 能量传递被阻断. 这一现象进一步证明复合物中存在分子内能量传递.     

PDCD4基因在过氧化氢诱导喉癌细胞凋亡中的作用

目的探讨过氧化氢诱导喉癌细胞Hep-2凋亡过程中PDCD4基因表达的变化。方法以体外培养的喉癌细胞Hep-2为实验材料,不同浓度的过氧化氢作用于Hep-2细胞,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生存率,采用吖啶橙染色、Ho33342/PI荧光双染进行形态学观察,RT-PCR及Western blot检测PDCD4 mRNA水平及蛋白表达的变化,评价在过氧化氢诱导喉癌细胞Hep-2凋亡过程中PDCD4基因的作用。结果过氧化氢(200μmol/L)作用Hep-2细胞24h,能够显著抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡,同时引起pdcd4 mRNA水平显著上调,PDCD4蛋白表达显著增加。结论本研究首次报道PDCD4基因可能在氧化胁迫诱导喉癌细胞凋亡中起关键作用。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.