马铃薯培养基中的根瘤菌自生固氮活性

以20％马铃薯提取液为主,加88毫克分子阿拉伯糖(或蔗糖、或葡糖酸盐)、2.5或25毫克分子琥珀酸钠以及0.7％琼脂,配成简易的马铃薯培养基。豇豆根瘤菌(Rhizobium sp·)330S、330V和32H1三个菌株,以及大豆根瘤菌(Rhizobium japonicum)C_8和B_(15)二个菌株纯培养在此培养基上,均具有自生固氮活性。 气相氧的浓度在0.75～2％时,根瘤菌的固氮活性最高。氧浓度超过10％时,活性显著被抑制。当根瘤菌的固氮酶活性已表达后,加入10％氧,2小时后活性就降低,44小时后随着气相氧浓度的下降,固氮活性又有所恢复。在加入不同碳源的马铃薯培养基中,根瘤菌固氮活性的水平因不同菌株而有差异。培养基中加入适当浓度的琥珀酸钠,根瘤菌固氮活性显著提高。培养基的pH在6.4～7.0范围内,豇豆根瘤菌的固氮活性较高,pH低于5.4或高于8.0时,都没有活性。预培养17天的豇豆根瘤菌仍有一定的固氮活性,但以5～7天的活性最高。分析马铃薯不同提取部分对根瘤菌生长和固氮活性的影响时,表明水溶部分比脂溶部分的效果好。     

南洋楹根瘤菌的分离和特性

从南洋楹新鲜根瘤中分离得到根瘤菌菌株8638,再经稀释分离,挑取不同形态的菌落,经连续单菌落纯化,获得8638L、8638M和86385三株菌落型．对它们的形态特征、培养性状、生长速度、生理生化特性进行观测．并对它们回接南洋楹后的结瘤状况和共生固氮活性,以及在自生条件下固氮酶和吸氢酶活性作了测定．     

根瘤菌与植物离体细胞培养物结合时的固氮活性

本文报道了根瘤菌和一些豆科及非豆科植物离体细胞培养物的结合固氮。豇豆型根瘤菌330、330 S 和32H1菌株与大豆(根、胚轴、子叶和叶子)细胞体外结合时均有固氮活性,与烟草叶片的细胞及马铃薯块茎的细胞体外结合时,固氮活性都比较高。在我们的试验中,豇豆型根瘤菌330和330 S 二个菌株的固氮活性都比32H1菌株的高。大豆根瘤菌(B_(15)、C_8和A_(84)菌株)与植物离体细胞结合时,固氮活性都不如豇豆型根瘤菌(330、330 S 和32H1)的高。不同种或品种的植物离体细胞培养物,对根瘤菌固氮活性有不同的影响。在我们的试验条件下,根瘤菌的固氮活性在注入乙炔1天后才开始出现,在一个月内随保温时间的延长,每瓶培养物中的乙炔还原成乙烯的量不断增高。但是,当以每克培养物的干重为单位时,在注入乙炔后5—10天内固氮活性增加较快,12天以后开始降低。根瘤菌在液体培养基中纯培养时,马铃薯的细胞悬浮液和马铃薯的提取汁都可以促进固氮酶活性的表达。     

根瘤菌吸氢酶基因转移的研究

通过三亲本杂交将含有花生根瘤菌吸氢基因的质粒pZ 55(Tcr)转入不吸氢的花生根瘤菌Ra 34等菌株 (Hup- ,Nif+,Apr)中 ,筛选到既具有吸氢又具有固氮能力的花生根瘤菌结合株Rz34 2。在自生和共生条件下 ,结合株均可表达高吸氢和高固氮活性。以结合株Rz34 2接种的花生植株叶片的干重比不接种的、接种受体株Ra34(Hup- )和接种对照菌株L8 3(Hup+,Nif+)的分别高 6.2 %、7.6%和 6.3% ;种子的含氮量分别高 8 9%、1.00 %和 6.0 % ;产量分别高 188%、1 0 5%和 1 0 7%。研究结果表明 ,以含吸氢基因的结合株接种花生能提高根瘤菌与花生的共生固氮效率 ,增加作物的产量。     

大豆—根瘤菌共生固氮氢代谢的研究

检测了四株大豆根瘤菌在不同的大豆品种上形成根瘤的放氢、吸氢、固氮活性及豆血红蛋白的含量;同时测定了植株干物质的积累。结果表明,所有固氮根瘤都放氢,自生条件下Hup~-根瘤菌形成的根瘤仍不具吸氢活性,相对固氮率在0.75左右。而Hup~(?)菌株根瘤的相对固氮率在0.91～1之间。寄主植物对Hup~(?)菌株的吸氢活性有影响。相关分析表明,根瘤的豆血红蛋白与吸氢活性呈负相关。干物质积累与固氮酶活性关系最密切,氢酶活性的影响是次要的。     

巴西固氮螺菌Yu62nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD-PCR法克隆了巴西固氮螺菌(Azospirillun brasilense)Yu62的nifA基因.序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源(96.5%),其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为97.6%.该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7 nifA-突变株的Nif-表型.研究了NH4+和O2对Yu62 nifA基因的表达及NifA活性的影响.结果表明mfA基因在Yu62菌株中是部分组成型表达的,氨和氧不能完全阻遏其表达,在5mmol/LNH4Cl与微氧(0.5%O2)条件下表达最高;NifA蛋白在0.4%～0.5%O2时活性最高,氧分压降低和提高都使NifA活性下降,1mmol/L NH4Cl足以抑制NifA的活性.     

华癸根瘤菌中自体诱导物的初步研究

群体感应 (Quorumsensing)是细菌通过产生可扩散的小分子量自体诱导物信号分子感知细胞群体密度变化 ,进行基因表达调控的生理行为。将根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)构建为超量表达群体感应调节蛋白TraR的检测菌株JZA1,试验证明该检测菌株能检测纳摩尔浓度的自体诱导物 ,利用该菌株对 3株不同华癸根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)进行自体诱导物活性检测 ,发现该 3株华癸根瘤菌均能产生自体诱导物 ,其表达量与菌体密度成正相关 ,但 3株菌在相同培养条件下自体诱导物的表达量存在差异 ,结果表明自体诱导物在种内水平上存在一定的多样性 ;同时发现高pH条件能大大降低自体诱导物的稳定性 ,为进一步研究群体感应调节在共生固氮上的作用提供理论及实践依据     

pH、温度、NH4+和盐度对圆果雀稗内生固氮菌固氮特性的影响

采用乙炔还原法对从圆果雀稗(Paspalum orbiculare)根、茎中分离到的5株内生固氮菌(POJy11、POG12、POGy22、POGy612、POG4)的固氮特性进行了研究。结果表明,POGy612、POG4固氮的pH适应范围是6.0-10.0,其余3株菌为6.0-8.0;POGy22固氮的最适温度为35℃,其余4株菌为30℃;随着NH4 浓度和NaCl浓度的升高,菌株固氮活性总体呈下降趋势,其中POGy22的固氮活性受NH4 抑制最明显,NH4 浓度为1.0 mmol/L时,已无固氮活性,但POGy612在NH4 浓度为2.5 mmol/L时的固氮活性最高,达到1 045.0 nmol ml-1h-1,POJy11、POGy22在NaCl浓度为0.5%时的固氮活性最高,分别达到735.5 nmol ml-1h-1、703.0 nmol ml-1h-1。     

根瘤菌纯培养乙炔还原的研究

证实了豇豆型根瘤菌Rhizobium sp.009菌株(为我国自己分离)的纯培养的固氮活力。根瘤菌纯培养固氮的诱导,最突出的一个问题,即重复性不好。我们以CS作固体诱导时的接种培养液及静止液体诱导两方法,分别解决了这两种诱导条件下重复性不好的困难,从而有可能就O_2和NH_2~ 对这一诱导活性的作用作进一步的观察和分析。在我们的固体诱导条件下009菌株的诱导活力高于32H1菌株,另外,在氧浓度稍高于最适诱导浓度且有过量铵存在时,无“铵抑制”效应的出现。     

Frankia sp．Asll和EaI827菌株的固氮研究

由辽东桤木和沙枣的根瘤中分离出两株内生菌(Frankia sp.),分别编号为Asll和EaI827。可在丙酸作碳源的限定培养基中诱导出泡囊,并表现较高固氮活性。不同浓度的NHt和水解酪蛋白对菌体的生长有促进作用,而对固氮活性却表现出明显的抑制作用。当氧分压为5％时,Asll菌株固氮活性较高,而F~1827菌株最适氧分压为1％。Asll菌株的固氮周期为8一11天,Eai827菌株在11一14天表现出较高的固氮活性。     

联合固氮菌Enterobactergergoviae57—7泌铵突变株的分离和特性

经 Tn5转座子诱变从野生型菌株 ( Enterobacter gergoviae 5 7- 7)筛选到抗甲胺 ( 0 .3mol/L )的泌铵突变株 MG61 ,该突变株在固氮生长时能分泌铵 2 .0 mmol/L。由于泌铵 MG61的生长比野生型菌株慢 ,在培养基中含铵 ( 5 mmol/L或 30 mmol/L)条件下 ,MG61的生长速率与对照相同 ,而远比野生型菌株慢 ,表明 MG 61不能很好地利用铵。在含 2 0 mmol/L铵的培养基中 MG 61仍表达 86%的固氮活性 ,而野生型菌株完全丧失了固氮活性。在谷氨酸存在下 MG61的生长速率及固氮酶活性都比对照高。在硝酸盐存在下 MG61的生长速率与对照相同 ,但泌铵量达 7.8mmol/L。     

MSX对光合细菌GOGAT缺失突变株(Nif~-)固氮酶的诱导

浑球红假单胞菌的谷氨酸合成酶突变株的培养物缺乏固氮活性,在加入谷氨酰胺合成酶抑制剂MSX后,固氮酶得以表达。MSX加入后对突变株的氮源多效缺陷无恢复作用,说明氮源多效缺陷与固氮酶不合成分属遗传和生理两种水平的改变。当野生型菌株的培养物中加入MSF后,固氮酶表达延迟,谷氨酰胺的加入加剧这一延迟效应。     

Tn5-Mob系统诱导根瘤菌属之间耐盐和共生性状的转移

本实验通过质粒pSUP501l及其辅助质粒RP4将Tn5-Mob随机插入苜蓿根瘤菌(Rhizo-bium meliloti 042B)的基因组中,得到86株接合子SR。随机选取4株SR,通过辅助质粒R68．45的三亲本杂交,将它们的DNA片段引入慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium,japo—nicum USDA 110),获得106株接合子BSR。大部分BSR菌株获得了生长快速的特性和耐盐性,一般能耐0．3—0．5m01／L Nacl,其中有些菌株能产生黑色素。将9o株BSR回接大豆和苜蓿植株,发现47株能在大豆和苜蓿植株结瘤,但在苜蓿卜无固氮活性;26株只能在大豆植株结瘤固氮;13株只能在苜蓿植株结瘤而不固氮;4株在大豆和菖蓿植株均不结瘤。其中,获得了4株耐盐性和固氮酶活性强的接合子。     

土壤杆菌固氮生理特性研究

对根癌土壤杆菌C58/pGV3850菌株的固氮生理特性研究结果表明,该菌具有自生固氮活性,其固氮活性的最适pH为8.0,温度为30℃.固氮活性在对数生长后期(14h)最高,延缓期和静止期乙炔还原活性较低.该菌株好氧,通过氧呼吸和吸氢酶的作用达到避氧固氮.当通入氧气超过呼吸耗氧时,对固氮活性产生抑制作用.在培养过程中增加NH_4~+浓度,固氮活性会降低,当达到15mmol/L时完全丧失固氮活性,表现NH_4~+阻遏固氮酶蛋白合成.在乙炔还原测定系统中加入NH_4~+并不影响乙炔还原反应,说明没有NH_4~+关闭现象.培养过程中加入MSX(2.5mg/ml)能解除10mmol/L NH_4~+对固氮酶合成的阻遏作用.固定的游离氮不能以NH_4~+形式分泌于胞外.固氮过程中放出大量氢气,培养16小时产氢量达65μmol H_2/mg蛋白.在限碳条件下(0.2%蔗糖)其吸氢酶活力可达520nmol H_2·ml~(-1)·h~(-1).     

自生条件下根瘤菌的氢酶表达与固氮的联系

在自生条件下,研究了根瘤菌的氢酶与固氮酶的共轭表达(coexpression)。氢酶表达受碳源限制和氧耗速率的调节,并为固氮酶表达条件促进,在固氮酶放氢的诱导下而与固氮酶共轭表达。此外,观察到外源氢支持根瘤菌自生固氮的活性,氢支持效应被葡萄糖酸钠和氧抑制。     

转座子Tn5诱变慢生大豆根瘤菌

用pSUP1011载体系统,Tn5诱变慢生大豆根瘤菌110、123,其KmR菌落出现频率为5x10-8一5x 10-7。Tn5的SmR。基因能在慢生大豆根瘤菌中表达。用卡那霉素加链霉素来筛选插入变株,可完全排除自然突变的干扰。从4450个KmR变株中检出营养缺陷型7株,其中His-(4)、Glu-(1)和Trp-(2),吸氢功能缺陷型10株,其中2株His-同时是吸氢缺陷(Hup-)和共生固氮缺陷(Nif-),其原养型回变体(回变频率为0.5×10-8)都同时恢复了吸氢与固氮功能,又失去了对卡那霉素的抗性。4株对氧特别敏感的Hup-缺陷型,在培养状态下无吸氢活性,但结瘤固氮时不放氢。     

紫色非硫光合细菌与大豆根瘤菌固氮作用的协同效应

从东北地区水稻及大豆根际分离出的两株紫色非硫光合细菌(球形红假单胞菌菌株N8611和胶质红假单胞菌菌株N84),分别与快生型大豆根瘤菌QB113以及慢生型大豆根瘤菌B16—11C共同培养时,其固氮比活与它们的纯培养菌相比有显著提高,说明这两类菌的固氮活性具有协同效应。两株光合细菌及其胞外组分,以及光合细菌与大豆根瘤菌共同培养时分离出的胞外组分,能显著加强由上述根瘤菌所形成根瘤的固氮活性。可以初步肯定,上述协同效应的原因之一是光合细菌胞外组分的刺激作用。     

浑球红假单胞菌GOGAT缺失株中依赖Z—酮戊二酸的固氮酶诱导

2—酮戊二酸加于限量氮培养基中后,引起泽球红假单胞菌谷氨酸合成酶(GOGAT)缺失菌株(asm~-,Nif~-)固氮酶的诱导表达,诱导生成的固氮酶的活性随着培养时间的延长而下降。此时如果加入谷氨酸,固氮酶活性又重新出现,而谷氨酸通常是阻遏GOGAT缺失菌株固氮酶表达的。诱导出的固氮酶与野生菌株固氮酶有相同的调节方式,但前后两次出现的固氮酶活性在氨的敏感性上有差异。此外,在GOGAT缺失菌株内含有较高的谷氨酰胺库,同时谷氨酸胺合成酶(GS)的腺苷酸化状态也较野生型菌株高。     

巴西固氮螺菌Yu62 nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD－PCR法克隆了巴西固氮螺菌（Azospirillun brasilense)Yu62和nifA基因。序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源（96．5％）,其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为97．6％。该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7 nifA^-突变株的Nif^-表型。研究了NH4^ 和O2对Yu62 nifA基因的表达及NifA活性的影响。结果表明：nifA基因在Yu62菌株中是部分组成型表达的,氨和氧不能完全阻遏其表达,在5mmol/LNH4Cl4与微氧（0.5%O2)条件下表达最高;NifA蛋白在0.4%-0.5%O2时活性最高,氧分压降低和提高都使NifA活性下降,1mmol/L NH4Cl足以抑制NifA的活性。     

在限定的培养基中马铃薯汁对根瘤菌乙炔还原的影响

在基本培养基中加适量的马铃薯汁,振荡培养根瘤菌330菌株,固氮酶比话性为111．6nmol C2H4／mg蛋白／h。而对照毫无活性。比较了几种细胞密度和气相氧浓度,发现加马铃薯汁能使反应系统内的气相氧浓度,在一 定时间内保持在l％左右。在这种氧浓度范围内,固氮酶活性激增。不加马铃薯汁的对照,因不能保持这种气相氧浓度,故无活性。对马铃薯汁所起的可能作用进行了讨论。