马铃薯单双三价抗病毒基因表达载体的构建

马铃薯Y病毒(PVY)、X病毒(PVX)和卷叶病毒(PLRV)引起的病害是造成我国马铃薯退化的主要原因,严重危害我国的马铃薯生产。PVY和PVX或PVY和PLRV混合侵染带来的损失远远大于各病毒单独侵染。国外科学家通过在马铃薯植株体内表达病毒外壳蛋白(CP)基因来减缓病毒病害的发生已取得相当的成功。 我们从河北省坝上地区农科所试验田中采集PLRV感病材料Burbank及87-1,参照文献提取病毒RNA并以其为模板,反转录合成cDNA。根据PLRV澳大利亚分离物已发表的序列,设计并     

施加外源抗坏血酸促进马铃薯试管薯形成及其机制初步研究

为研究抗坏血酸(AsA)处理对马铃薯试管薯形成和结薯相关基因表达的影响及敲除结薯关键基因Solanum tuberosum self-prunning 6A(StSP6A)对AsA诱导马铃薯结薯的效应,利用不同浓度(0、1、5、10、20和50 mmol/L)外源AsA处理2个二倍体马铃薯CIP-149(Solanum phureja)、CIP-178(S.ajanhuiri)和四倍体C-88(S.tuberosum)。结果表明,1~5 mmol/L外源AsA处理可显著诱导马铃薯块茎的形成。对10个块茎形成相关基因的表达分析结果表明,外源添加1 mmol/L AsA可显著影响块茎形成相关基因的表达,与对照相比,总体上呈正调控基因表达增强或负调控因子表达被抑制的趋势,特别是StSP6A在AsA处理过程中的块茎形成早期表达量极显著上调,敲除StSP6A可消除外源AsA对马铃薯块茎形成的诱导作用。这些结果表明,AsA诱导马铃薯块茎形成是通过调控与块茎形成相关的基因表达来实现的,而StSP6A在AsA诱导马铃薯块茎形成中起关键作用。     

沉默马铃薯Sgt1-3基因减少块茎糖苷生物碱积累北大核心CSCD

马铃薯茄啶-糖基转移酶(solanidine glycosyltransferase,Sgt)家族成员Sgt1、Sgt2和Sgt3参与糖苷生物碱(glycoalkaloids,GAs)合成。已有研究证明,抑制该家族任一成员表达可影响马铃薯块茎中糖苷生物碱合成;然而,对Sgt家族成员的单基因实施调控很难有效降低块茎中总糖苷生物碱的积累。为降低马铃薯块茎中总糖苷生物碱的含量,本研究拟采用RNAi技术,对糖苷生物碱合成代谢途径末端酶基因家族成员Sgt1-3在转录水平进行共调控。为实现这一目的,构建了块茎特异性启动子Patatin驱动的,以Sgt1、Sgt2和Sgt3基因为靶向的RNAi表达载体p CEI-PFR,采用农杆菌介导法转化马铃薯茎段,获得10株可沉默Sgt1、Sgt2和Sgt3基因表达的Patatin-RNAi融合基因的转基因植株。实时定量PCR(RT-q PCR)结果显示,Sgts基因的相对表达量分别降低了大约32%~60%(Sgt1)、29%~55%(Sgt2)和25%~66%(Sgt3),而草甘膦抗性基因——5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)的表达量则增加了约48%~135%。高效液相色谱法(HPLC)证明,尽管转基因株系的绿色组织中糖苷生物碱含量与野生型无显著差异,但块茎中糖苷生物碱分别比野生型降低了46%~59%(庄薯3号)和42%~62%(Favorita)。上述结果提示,复合沉默茄啶-糖基转移酶家族基因可降低马铃薯块茎中糖苷生物碱的积累。此外,该结果可能对研究马铃薯不同组织间糖苷生物碱的分布和积累,以及马铃薯种质资源的创新开发具有一定启示。     

美发现抗马铃薯晚疫病基因

Resource 2003年10卷9期4页报道：已知马铃薯晚疫病是由疫霉(Phytophthora spp．)引起的严重的真菌病。目前美国商业种植的全部马铃薯品种均高度易感马铃薯晚疫病。为了防治这种病害,最近美国威斯康星大学麦迪逊分校的植物病理学教授和美国农业部农业研究署的研究员John Helgeson及其同事已利用基因工程,将从墨西哥野生马铃薯(Solanum bulaocastanum)基因组中分离出来的抗马铃薯晚疫病的单基因,转移于栽培马铃薯。结果证实,这些转基因马铃薯可成功地抵抗多种疫霉的感染。     

致病疫霉PiSAK1的生物学功能分析

【背景】致病疫霉是引起世界范围内马铃薯晚疫病的重要病原菌。Stress-activated protein kinases (SAPKs)是一类胁迫激活的mitogen-activated protein kinases (MAPKs)，研究表明真菌SAPKs在调控细胞应答外界胁迫等方面有重要作用。致病疫霉中存在一个SAPK，即PiSAK1，其生物学功能并不明确。【目的】探究PiSAK1在致病疫霉生长发育、抵抗外界胁迫及侵染马铃薯过程中发挥的生物学功能。【方法】利用生物信息学手段分析PiSAK1的特性，通过RT-qPCR分析明确致病疫霉PiSAK1在不同发育阶段及侵染马铃薯不同时期的表达量，最后构建PiSAK1沉默、过表达菌株并测定其各项生物学表型。【结果】PiSAK1具有丝裂原活化蛋白激酶典型的Ser/Thr蛋白激酶催化结构域，并且与其他卵菌的SAPKs同属一个进化分支。致病疫霉PiSAK1分别在休止孢阶段、侵染马铃薯48 h时表达量最高，且0.3 mol/L NaCl及3 mmol/L H2O2胁迫刺激0.5 h后PiSAK1的表达量均显著升高。构建PiSAK1沉默、过表达菌株并测...     

彩色马铃薯花青素生物合成相关microRNAs及其靶基因表达分析北大核心CSCD

MicroRNAs(miRNAs)是植物中具有调控功能的非编码小RNA,可调节植物生长发育、次生代谢及胁迫响应。为挖掘彩色马铃薯花青素合成相关的miRNAs,本研究基于miRNA和降解组测序数据,对筛选出和花青素相关的miRNA及靶基因进行鉴定,分析其理化性质、蛋白质结构、调控关系及在不同彩色马铃薯品种的表达。结果表明:stu-miR156a_R-1_StSPL9、stu-miR828_StMYB3、stu-miR858_StMYB4、stu-miR5021_StMYB在马铃薯块茎的不同发育时期存在显著的负相关关系。不同彩色马铃薯品种中,stu-miR828负调控靶基因StMYB3,抑制花青素合成;stu-miR156a_R-1负调控靶基因StSPL9,促进花青素合成。stu-miR858负调控靶基因StMYB4,在紫色马铃薯中促进花青素合成,在红色马铃薯中抑制花青素合成。stu-miR5021负调控靶基因StMYB,在紫色马铃薯中抑制花青素合成,在红色马铃薯中促进花青素合成。     

PEG模拟干旱胁迫下马铃薯茎段转录组分析

该研究以‘青薯9号’马铃薯无菌苗为材料,采用转录组测序技术分析模拟干旱胁迫下马铃薯茎段的差异表达,探究茎段在干旱胁迫下的分子机制。结果表明:(1)不同程度干旱胁迫下,马铃薯叶片脯氨酸、可溶性糖以及可溶性蛋白含量明显增加;马铃薯茎段差异表达基因下调的数量均多于上调,其中3种处理条件下共有的差异表达基因有657个。(2)GO富集分析表明,马铃薯茎段差异表达基因主要集中在氧化还原过程、激素响应、氧化还原酶活性以及糖基水解酶活性;Pathway富集分析表明,马铃薯茎段差异表达基因主要集中在植物激素信号转导、苯丙酸生物合成、玉米素生物合成、苯丙氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢以及次生代谢产物的生物合成。(3)实时荧光定量PCR验证结果表明,6个差异表达基因在不同程度干旱胁迫中的差异表达与转录组分析的结果基本一致,证明转录组数据的可靠性。该结果对进一步研究马铃薯干旱胁迫响应机制有一定参考价值,也丰富了马铃薯抗旱育种的基因资源。     

cDNA文库与RACE方法结合克隆一个马铃薯病程相关蛋白基因cDNA

为克隆马铃薯晚疫病抗性相关基因,深入研究马铃薯晚疫病抗性机制,应用SMART LD—PCR技术,以晚疫病菌混合小种诱导48h的水平抗性马铃薯(Solanum tuberosum L．)(R—gene—free)叶片为材料,构建了一个富集晚疫病抗性相关基因的cDNA文库。为提高克隆全长cDNA的效率,将cDNA文库与RACE技术结合,依据本实验室得到的病原诱导表达片段测序结果,在其内部设计两个特异引物,与文库载体臂上的通用引物配对,以文库噬菌体DNA为模板,用高保真PCR分别扩增出cDNA5′端与3′端,从而简便、快捷地得到全长cDNA序列。采用此方法,在马铃薯中克隆了一个受晚疫病菌诱导表达的cDNA,该cDNA长904bp,5′端有29bp的非翻译区,3′端具有完整的polyA尾,包含一个678bp的完整开放阅读框架,编码226个氨基酸(GenBank登录号：AY 185207)。BLAST检索发现其氨基酸序列与烟草一个新的病程相关蛋白基因NtPRp27具有90％的同源性,在马铃薯中尚未发现与之同源的已知基因。Northern杂交结果表明,水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、机械伤害和渗透胁迫都能诱导该基因表达。该基因可能是马铃薯一个新的病程相关蛋白基因。     

紫色马铃薯花青素StAN1基因的克隆及功能分析

MYB是植物花青素合成代谢途径中最主要的转录因子。该研究以紫色马铃薯B-5为试验材料,通过同源克隆技术,克隆了马铃薯花青素StAN1基因,并对StAN1基因的表达、遗传转化及其转基因烟草的花青素含量进行分析。结果表明:(1)StAN1基因全长774bp,编码了258个氨基酸;系统进化树分析发现,StAN1与辣椒、茄子、芦竹的亲缘关系最近,与矮牵牛、苹果等的亲缘关系最远。(2)荧光定量PCR分析显示,StAN1基因在马铃薯不同组织均有表达,其表达量从小到大依次为:根叶茎匍匐茎薯皮薯肉。(3)成功构建了表达载体pJAM1502-AN1,并经农杆菌(Gv3101)转化获得根、茎、叶片及叶脉均为紫红色的转StAN1基因烟草,PCR鉴定表明目的基因StAN1已成功转入烟草中。(4)花青素含量分析表明,野生型烟草叶片中花青素含量为2mg/g,叶片颜色为绿色,而转StAN1基因烟草叶片花青素含量达20mg/g,叶片颜色变成了紫红色。     

马铃薯α-淀粉酶基因的克隆及生物信息学分析(英文)

本研究利用RT-PCR从马铃薯(Solanum tuberosum)茎段总RNA中扩增、克隆了一cDNA分子。该cDNA分子含有一长为1224bp的开放读框,可编码一含407个氨基酸残基的多肽、理论分子量为46.40kD、可能为亲水性的胞外酶。因其氨基酸序列同源于α-淀粉酶,故将该基因命名为amyA1(NCBI收录号:GQ406048.1)。采用半定量RT-PCR方法检测了amyA1基因在马铃薯茎、叶等不同组织中的表达强度,表明在茎组织中的表达丰度略高。利用生物信息学软件分析了amyA1密码子的偏好性,以期为选择适宜的表达系统提供依据;同时对amyA1的理化性质、细胞内定位、保守结构及高级结构进行了预测。基于NCBI数据库中有物种代表性的29种α-淀粉酶基因序列构建了基因进化树。与NCBI收录的马铃薯α-淀粉酶基因(NCBI收录号:M79328.1)的核苷酸及氨基酸序列同源性达98%。第20至第348范围内的氨基酸残基含有与淀粉酶13家族及亚家族相似的催化活性域(PF00128、SM00624),第349至第407范围内的氨基酸残基含有α-淀粉酶C-末端β折叠区域(PF07821)。蛋白质结构预测表明氨基酸残基序列有维持淀粉酶活性的(β/α)8桶状结构以及其它几个功能域结构。所构建的基因进化树表明,2个马铃薯α-淀粉酶基因与木薯、苹果的序列同源性较高,与菜豆的次之,与水稻、大麦和玉米等单子叶植物的序列同源性较低。     

转禽冠状病毒免疫原基因马铃薯及其对小鼠的免疫原性

为了探索禽冠状病毒免疫原基因在植物中表达的可行性 ,将传染性支气管炎病毒 (IBV) ZJ971毒株S1基因定向克隆到pBI1 2 1质粒的 35S启动子下游。用三亲交配法将重组质粒导入EHA1 0 5根癌农杆菌 ,建立了一种由农杆菌介导的马铃薯转化体系 ,其愈伤形成率达 1 0 0 % ,芽的分化率达 95 %。经PCR和Southern印迹检测证明 ,IBVS1基因已整合到植物基因组内 ,获 4 7株转基因植株。Northern印迹和ELISA分析表明 ,转基因植株中IBVS1基因能正常转录和翻译。转基因马铃薯的BALB/C小鼠免疫试验结果表明 ,0 .5g和 1 g剂量转基因马铃薯免疫小鼠 ,2 1天后的抗体ELISA效价分别达 1∶2 0～ 1∶4 0和 1∶80 1∶1 6 0 ,中和抗体效价分别达 1∶1 6 5～ 1∶5 6 2和 1∶330～ 1∶2 0 4 8,说明禽冠状病毒免疫原基因的转基因马铃薯表达产物具有免疫原性     

马铃薯POTHR-1 cDNA的克隆及晚疫病菌和其他非生物因子诱导表达分析

利RACE和重叠延伸相结合的方法,从经晚疫病菌接种诱导的马铃薯水平抗性材料叶片中克隆了一个POTHE 1基因(potato Phytophthora infestans induced hypersensitive response related protein gene)的全长cDNA.序列分析表明,该基因编码225个氨基酸,与烟草harpin诱导蛋白基因hinl有很高的同源性(编码区核苷酸和氨基酸序列分别为83%和81%).Southern杂交结果显示在马铃薯基因组中有2～3个拷贝.对其诱导表达模式研究表明:晚疫病病原菌接种36 h后,该基因表达迅速增加;机械伤害及茉莉酸(JA)处理能够诱导表达;渗透胁迫(NaCl浸泡)能够诱导其微弱表达;但水杨酸(SA)不能诱导表达.该基因可能和病原与寄主互作时寄主产生过敏反应及细胞生理性死亡有关.     

Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因转化马铃薯的研究

为获得抗旱性强、生长正常的转基因马铃薯植株,以野生拟南芥生态型(Col-0)为材料,利用PCR和DNA重组技术,克隆了拟南芥Rd29A(responsive to dehydration)基因ATG上游+83bp至-1 441bp共1 524bp的启动子区域,其DNA序列与已知拟南芥Rd29A 5'端启动子序列同源性为100%;构建了Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因表达的植物表达载体pCHFRd-CDPK1。以马铃薯品种‘费乌瑞它’的试管微型薯为材料,利用农杆菌介导法,将构建成功的pCHFRd-CDPK1载体转入马铃薯中,经筛选与植株再生,获得抗性再生植株。通过PCR和Southern blot检测显示,Rd29A启动子驱动的AtCDPK1基因已整合在马铃薯的基因组中。利用PEG模拟干旱胁迫后,经RT-PCR分析证实,当用20%的PEG胁迫转基因马铃薯植株时,Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因表达的转基因马铃薯各个株系中AtCDPK1基因表达量明显增强,而在无胁迫的条件下,植株中AtCDPK1基因基本不表达;同时发现35S控制AtCDPK1转基因植株在PEG胁迫前后,基因转录未见明显差异。形态学观察还表明,在30%PEG胁迫下,转基因植株能正常生长,其长势优于未转基因的对照,且对照植株略有萎焉。该结果可为进一步利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在农作物中的表达研究及其遗传改良提供依据。     

马铃薯Y病毒衣壳蛋白基因片段长度对RNA介导抗病性的影响

在已证明转化马铃薯Y病毒(PVY)全长衣壳蛋白基因可获得高度抗病的转基因烟草、且这种抗病性为RNA介导抗病性的基础上, 克隆了马铃薯Y病毒坏死株系衣壳蛋白基因(PVY^N-CP) 3′端202 (1/4 CP), 417 (1/2 CP)和603 bp (3/4 CP)的部分基因片段(CP202, CP417和CP603), 并分别构建植物表达载体pROKⅡ-CP202, pROKⅡ-CP417和pROKⅡ-CP603. 利用农杆菌介导方法转化烟草NC89. 抗病性鉴定表明, 转化1/2 CP和3/4 CP基因片段的转基因烟草均可获得抗病程度达到免疫的植株, 而转化1/4 CP的基因片段没有获得抗病植株. 分子分析结果表明这种抗病性为RNA介导的抗病性, 是转录后基因沉默的结果. 研究表明, 能够诱发RNA介导抗病性所需的PVY-CP基因的最短有效片段长度可能介于202和417 bp之间. 这一研究结果对改进利用转录后基因沉默策略来防治植物病毒病害以及研究转录后基因沉默机制具有意义.     

马铃薯HSP17.7基因的克隆及其对高温逆境的响应

热激蛋白和植物对高温的响应密切相关,同时在植物生长发育调控和逆境抵抗等方面具有重要作用。该研究克隆了马铃薯热激蛋白基因StHSP17.7(GenBank登录号为XP_006350804.1),对其全长cDNA序列进行了相关生物信息学分析,并利用qRT-PCR分析StHSP17.7基因在高温胁迫下的差异表达特性。结果显示:(1)StHSP17.7全长755bp,包含465bp开放阅读框,编码154个氨基酸。(2)StHSP17.7分子质量约为17.62kD,等电点7.91,为亲水性蛋白,C端含有保守序列Ⅰ和Ⅱ组成的ACD结构域,属于典型的sHSPs家族成员。(3)系统进化分析发现马铃薯小分子热激蛋白归为12个亚家族,其中StHSP17.7与马铃薯HSP17.6蛋白亲缘关系较近,属于小分子热激蛋白C的Ⅰ类家族成员;基因结构分析显示,在马铃薯48个sHSP基因中,StHSP17.7基因不含内含子,含1个内含子的基因有23个,占47.9%。(4)qRT-PCR分析显示,高温能够快速诱导StHSP17.7基因表达,且基因表达量呈爆发式变化,在24h达到最高值。研究表明,StHSP17.7基因明显参与了马铃薯对高温的响应。     

两种野生寄主对马铃薯甲虫繁殖策略及后代生长发育的影响

为明确野生寄主植物对马铃薯甲虫种群繁殖及生长发育方面的影响,本研究比较了天仙子、刺萼龙葵2种野生寄主对马铃薯甲虫产卵量、孵化率、发育历期以及种群生命参数的影响.结果表明:取食不同寄主植物的马铃薯甲虫产卵量和孵化率均有显著差异(P＜0.05),卵期无显著差异(P＞0.05),取食天仙子的雌虫产卵量显著低于取食马铃薯和刺萼龙葵雌虫产卵量;1龄幼虫的存活率有显著性差异(P＜0.05),取食天仙子的雌虫的下一代1龄幼虫存活率显著低于其他寄主植物1龄幼虫;取食不同寄主植物的下一代马铃薯甲虫种群净增值率(R0)、内禀增长率(rm)、周限增长率(λ)都有显著差异(P＜0.05),世代平均周期(T)无显著性差异(P＞0.05);取食天仙子的马铃薯甲虫下一代种群净增值率(R0)、内禀增长率(rm)、周限增长率(λ)显著小于取食马铃薯、刺萼龙葵的下一代种群.由此可知,天仙子作为马铃薯甲虫野生过渡寄主植物,对马铃薯甲虫种群繁殖策略的作用弱于马铃薯和刺萼龙葵.在马铃薯甲虫前沿分布区,应进一步加强对刺萼龙葵野生寄主的铲除,防止马铃薯甲虫种群进一步扩散,保障马铃薯产业健康发展和粮食安全.     

根癌农杆菌介导的CMO基因转化马铃薯的研究

通过根癌农杆菌介导法将强组成型表达启动子CaMV 35S和逆境诱导表达启动子rd29A 驱动的菠菜胆碱单加氧酶(CMO)基因导入马铃薯栽培品种夏波蒂(Shepody)和费乌瑞它( Favorita)中,获得了抗卡那霉素再生植株,对转化植株进行PCR检测初步表明CMO基因已整 合到转基因马铃薯基因组中.并对光照强度对马铃薯试管薯遗传转化的影响进行了研究,结果表明在诱导芽分化的过程中,2 000 lx的光照强度有利于试管薯薄片直接再生出抗性芽.     

口蹄疫病毒VP1基因转化马铃薯及其块茎专一性表达

报道了FMDV VP1基因与马铃薯块茎专一性表达class Ipatatin基因5′区融合,经农杆菌介导导入马铃薯植株,PCR、RT-PCR证实了其整合及转录表达。ELISA结果进一步表明,VP1在转基因马铃薯块茎中具有免疫活性。为探讨在马铃薯块茎中高表达VP1蛋白及进一步开发其作为FMDV口服疫苗生物反应器奠定基础。     

间作作物种间相互作用对马铃薯根际土壤丛枝菌根真菌的影响

为揭示间作作物种间相互作用对土壤丛枝菌根(AM)真菌的影响,以马铃薯单作(T0)为对照,基于高通量测序平台的方法,研究了连续3年马铃薯‖玉米(T1)、马铃薯‖蚕豆(T2)下马铃薯根际土壤AM真菌群落组成、多样性与土壤环境因子间的相互关系.结果表明:共获得2893个AM真菌操作分类单元(OTUs),分属1门、3纲、4目、...     

水稻10kD富硫醇溶蛋白基因在马铃薯中的表达

将水稻(Oryza sativa L.)10 kD富硫醇溶蛋白基因。cDNA(PLG)分别与Patatin Class I启动子、CaMV35S启动子和NOS 3＇终止子融合,构建了表达载体pBinLG、pBinLGP。表达载体通过直接法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(pAL4404),然后转化马铃薯(Solanum tuberosum L.)薯块,在含有100mg/L卡那霉素的抗性培养基上再生成植株。对抗性植株的NPTⅡ酶活性检测、总DNA的PCR扩增及Southern杂交、总RNA的点杂交、蛋白质Western杂交,证明目的基因已导入马铃薯细胞中,整合到马铃薯基因组上,井能正确地表达。