被孢霉△9脂肪酸脱饱和酶基因保守区的cDNA克隆及结构分析*

被孢霉被广泛采用用于发酵生产Y一亚麻酸、花生四烯酸和EPA等多不饱和脂肪酸。为了解决发酵产率过低等诸多问题,我们拟采用基因工程技术改造生产菌株。通过对已克隆△9脂肪酸脱饱和酶基因的分析,合成一组简并引物,PCR扩增了被饱霉△9脂肪酸脱饱和酶基因的保守区。结果表明被孢霉△9脂肪酸脱饱和酶基因保守区由537个核苷酸组成,共编码179个氨基酸。其与迄今为止发表的微生物△9脂肪酸脱饱和酶基因有很高的同源性。这是被饱霉△9脂肪酸脱饱和酶基因研究的次次报道。     

被孢霉Δ^9脂肪酸脱饱和酶基因保守区的cDNA克隆及结构分析

被孢霉被广泛采用用于发酵生产γ－亚麻酸、花生四烯酸和ＥＰＡ等多不饱和脂肪酸。为了解决发酵产率过低等诸多问题,我们拟采用基因工程技术改造生产菌株。通过对已克隆Δ＾９脂肪酸脱饱和酶基因的分析,合成一组简并引物,ＰＣＲ扩增了被饱霉Δ＾９脂肪酸脱饱和酶基因的保守区。结果表明被孢囊Δ＾９脂肪酸脱饱和酶基因保守区由５３７个核苷酸组成,共编码１７９个氨基酸。其与迄今为止发表的微生物Δ＾９脂肪酸脱饱和酶基因有很高     

被孢霉cDNA文库的构建及△^9脂肪酸脱饱和酶cDNA序列的筛选

为了克隆被孢霉不饱和脂肪酸生物合成途径的相关酶基因,构建了基于λgt10的被孢霉cDNA文库.cDNA文库库容量为2×106pfu.以已克隆的被孢霉△9脂肪酸脱饱和酶保守区cDNA为探针对被孢霉cDNA文库进行筛选.经过两轮筛选获得1个阳性克隆,其插入片段长度大于1.6kb.     

被孢霉cDNA文库的构建及△９脂肪酸脱饱和酶cDNA序列的筛选

为了克隆被孢霉不饱和脂肪酸生物合成途径的相关酶基因,构建了基于λgt10的被孢霉cDNA文库。cDNA文库库容量为2×１０.６pfu。以已克隆的被孢霉△９脂肪酸脱饱和酶保守区cDNA为探针对被孢霉cDNA文库进行筛选。经过两轮筛选获得1个阳性克隆,其插入片段长度大于16kb。     

海洋真菌Thraustochytrium sp.FJN-10 △4脱饱和酶基因的cDNA克隆及结构分析

海洋真菌Thraustochytrium sp.FJN-10是二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA,C22:6n-3)的高产菌株.为阐明其DHA生物合成机制及采用基因工程技术提高DHA生物合成能力,通过RT-PCR扩增了DHA生物合成相关脱饱和酶基因的保守区,采用cDNA末端扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)获取全长基因,结果分析表明其克隆基因为△4脂肪酸脱饱和酶基因,开放阅读框由1560个核苷酸组成,共编码519个氨基酸,这是Thraustochytrium sp.FJN-10△4脂肪酸脱饱和酶基因研究的首次报道.     

深黄被孢霉△5-脱饱和酶基因在花生四烯酸合成中的作用

【目的】研究△5-脱饱和酶基因的mRNA表达量与花生四烯酸产量之间的关系。【方法】实验利用荧光定量PCR方法检测了△5-脱饱和酶在五株深黄被孢霉的同一培养时间及菌株YZ-124在不同发酵阶段的mRNA表达水平,同时利用气相色谱仪测定其花生四烯酸含量。【结果】结果表明:不同菌株的△5-脱饱和酶基因的mRNA表达水平不同,原始菌株As3.3410最低,诱变菌株YZ-124最高;深黄被孢霉YZ-124不同发酵阶段的△5-脱饱和酶基因mRNA表达量随菌龄的增加逐渐增加。【结论】结合ARA的得率显示,△5-脱饱和酶基因mRNA表达量与培养物油脂中ARA含量呈一定的正相关关系。     

深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（ＧＬＡ,Ｃ１８：３△６,９,１２）是由△６－脂肪酸脱氢酶以亚油酸（ＬＡ,Ｃ１８：２△９,１２）为底物,在Ｃ６位脱氢形成的。由于在人体中,γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物,而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物,利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△６－脂肪酸脱氢酶的ｃＤＮＡ,全长为１３７４个核苷酸,编码４５７ 个氨基酸,但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是, △６－脂肪酸脱氢酶在其序列的 Ｎ 端特有细胞色素 ｂ５（Ｃｙｔｂ５）区。这是国际上对深黄被孢霉△６－脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。     

深黄被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（GLA,C18：3△^6,9,12）是由△^6-脂肪酸脱氢酶以亚油酸（LA,C18：2△^9,12)为底物,在C6位脱氢形成的。由于在人体中,γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物,而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物,利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△^6-脂肪酸脱氢酶的cDNA,全长为1374个核苷酸,编码457个氨基酸,但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是,△^6-脂肪酸脱氢酶在其序列的N端特有细胞色素b5(Cytb5)区。这是国际上对深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。     

高山被孢霉△5脱饱和酶基因的分离与验证

花生四烯酸（arachidonic acid）是人体的必需脂防酸,具有独特的生物活性。△5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径上的关键酶,以二高-γ-亚麻酸为底物,催化其第5位碳脱氢形成花生四烯酸。从花生四烯酸高产菌株高山被孢霉M6（Mortierella alpina）中通过RT—PCR分离了可能的编码△5脱饱和酶完整的cDNA,其大小为1366bp,编码446个氨基酸。推导出的蛋白质含有△5脂酰脱饱和酶中保守的特征性结构域,包括该蛋白质N端典型的细胞色素b。结构域,以及3个保守的组氨酸盒。为验证该蛋白质的功能,将该基因片段克隆到穿梭表达载体pPIC9K中,获得的重组载体pPIC9K-D5通过电转化法转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,利用G418耐受度筛选出高拷贝数的酵母转化子,在加入外源底物二高-γ-亚麻酸时,利用甲醇诱导酵母转化子表达外源基因。酵母转化子的油脂的气相色谱图谱中出现了一个花生四烯酸的特征峰,进一步对该峰进行气质联谱（GC—MS）分析,证实该峰是花生四烯酸。研究结果表明,从高山被孢霉M6中分离出△5脱饱和酶基因。     

海洋真菌Thraustochytrium sp.FJN-10 Δ~4脱饱和酶基因的cDNA克隆及结构分析

海洋真菌Thraustochytriumsp.FJN-10是二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA,C22:6n-3)的高产菌株。为阐明其DHA生物合成机制及采用基因工程技术提高DHA生物合成能力,通过RT-PCR扩增了DHA生物合成相关脱饱和酶基因的保守区,采用cDNA末端扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)获取全长基因,结果分析表明其克隆基因为Δ4脂肪酸脱饱和酶基因,开放阅读框由1560个核苷酸组成,共编码519个氨基酸,这是Thraus-tochytriumsp.FJN-10Δ4脂肪酸脱饱和酶基因研究的首次报道。     

高山被孢霉中Δ9脂肪酸脱饱和酶的表达、纯化和其细胞色素b_5功能域的鉴定

在毕赤酵母中表达和纯化源自高山被孢霉ATCC 32222的膜结合Δ9-I脂肪酸脱饱和酶,测定其活性,并探究其细胞色素b_5功能域的性质。构建含有高效纯化标签ZZ-tag的表达载体;用Western blotting和SDS-PAGE筛选Δ9-I脂肪酸脱饱和酶高表达量转化子;通过梯度离心和去垢剂筛选确定膜蛋白质提取条件;采用IgG亲和纯化色谱和阴离子交换色谱对Δ9-I脂肪酸脱饱和酶进行纯化;利用酿酒酵母细胞破碎物为底物考察Δ9-I脂肪酸脱饱和酶活性;通过波长扫描和Na_2S_2O_4还原实验对Δ9-I脂肪酸脱饱和酶细胞色素b_5功能域进行表征。结果显示,目的蛋白质被成功表达并筛选出高表达量转化子;20 000g离心1h为最佳膜分离条件,Fos-Choline-16为最佳去垢剂;纯化后的Δ9-I脂肪酸脱饱和酶结构完整,具有细胞色素b_5功能域;在酿酒酵母提取物中Δ9-I脂肪酸脱饱和酶对C16:0和C18:0底物的转化效率分别为(16.88±9.32)%和(20.61±7.55)%;波长扫描显示Δ9-I脂肪酸脱饱和酶在411nm处有强吸收,并且在Na_2S_2O_4作用下被还原至422nm,说明细胞色素b_5功能域在体外能够被还原。因此,含有细胞色素b_5功能域的脂肪酸脱饱和酶的首次成功表达、纯化和鉴定为亚铁血红素脂肪酸脱饱和酶脱饱和反应机制的研究奠定了基础。     

深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（ＧＬＡ,Ｃ１８：３△_{６,９,１２}）是由△_６－脂肪酸脱氢酶以亚油酸（ＬＡ,Ｃ１８：２△_９,１２）为底物,在Ｃ_６位脱氢形成的。由于在人体中,γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物,而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物,利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△_６－脂肪酸脱氢酶的ｃＤＮＡ,全长为１３７４个核苷酸,编码４５７ 个氨基酸,但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是, △_６－脂肪酸脱氢酶在其序列的 Ｎ 端特有细胞色素 ｂ_５（Ｃｙｔｂ_５）区。这是国际上对深黄被孢霉△_６－脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。     

雅致枝霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

根据真菌△^6 -脂肪酸脱氢酶基因保守的组氨酸Ⅱ区和Ⅲ区附近保守序列设计兼并引物进行RT-PCR,得到雅致枝霉（Thamnidium elegans）As3．2806△^6 -脂肪酸脱氢酶基因459bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术（RACE）向两端延伸得到1504bp的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个1377bp、编码459个氨基酸的开放阅读框TED6。推测的氨基酸序列与已知其他真菌的△^6 -脂肪酸脱氧酶基因的氨基酸序列比对,具有3个组氨酸保守区、2个疏水区及N末端细胞色素b5融合区。将此编码区序列亚克隆到酿酒酵母缺陷型菌株INVSel的表达载体pYES2.0中,构建表达载体pYTED6,并在酿酒酵母INVSel中异源表达。通过气相色谱（GC）和气相色谱,质谱（GC-MS）分析表明,该序列在酿酒酵母中获得表达,产生γ-亚麻酸（GLA）的含量占酵母总脂肪酸的7．5％。证明此序列编码的蛋白能将外加的亚油酸转化为γ-亚麻酸,是一个新的有功能的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因（GenBank．AY941161）。     

匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）As 3.38△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆与酵母表达

通过气相色谱法(GC)快速分析8种真菌的脂肪酸成分,发现匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)具有较高的γ-亚麻酸含量,利用RT-PCR和RACE方法获得了全长为1475bp的匍枝根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的cDNA序列,其中开放阅读框为1380bp,编码459个氨基酸。生物信息学分析所克隆的基因具有△6-脂肪酸脱氢酶的典型结构:N端具有细胞色素b5结构、具有3个保守的组氨酸区序列和跨膜结构;把该基因的开放阅读框序列连接到表达载体pYES2.0上,构建重组表达载体pYRnD6D,并将其转入缺陷型酿酒酵母INVScl中进行表达。GC分析表明,该序列在酵母中获得了表达,表达产物表现出△6-脂肪酸脱氢酶的酶学活性,能将底物亚油酸转化为γ-亚麻酸。新生成的γ-亚麻酸占酵母细胞总脂肪酸的12.25%。     

高山被孢霉Δ5脱饱和酶基因的分离与验证

花生四烯酸(arachidonicacid)是人体的必需脂肪酸,具有独特的生物活性。Δ5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径上的关键酶,以二高-γ-亚麻酸为底物,催化其第5位碳脱氢形成花生四烯酸。从花生四烯酸高产菌株高山被孢霉M6(Mortierellaalpina)中通过RT-PCR分离了可能的编码Δ5脱饱和酶完整的cDNA,其大小为1366bp,编码446个氨基酸。推导出的蛋白质含有Δ5脂酰脱饱和酶中保守的特征性结构域,包括该蛋白质N端典型的细胞色素b5结构域,以及3个保守的组氨酸盒。为验证该蛋白质的功能,将该基因片段克隆到穿梭表达载体pPIC9K中,获得的重组载体pPIC9K-D5通过电转化法转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,利用G418耐受度筛选出高拷贝数的酵母转化子,在加入外源底物二高-γ-亚麻酸时,利用甲醇诱导酵母转化子表达外源基因。酵母转化子的油脂的气相色谱图谱中出现了一个花生四烯酸的特征峰,进一步对该峰进行气质联谱(GC-MS)分析,证实该峰是花生四烯酸。研究结果表明,从高山被孢霉M6中分离出Δ5脱饱和酶基因。     

海洋破囊壶菌△4-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒母中的表达

以质粒pGEM-TFAD4为模板,扩增获得1.6 kb的△4-脂肪酸脱饱和酶基因(FAD4).将FAD4酶切后连接到Hond Ⅲ/XbaⅠ处理过的pYES2.0载体,构建重组表达质粒pYFAD4.转化酿酒酵母缺陷型菌INVScl,通过SC-U选择性培养基筛选阳性克隆子.添加外源脂肪酸C22:5底物,半乳糖诱导表达.气相色谱分析表明阳性克隆子总脂肪酸中出现了二十二碳六烯酸C22:6(占酵母总脂肪含量的41.13%),△4-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒酵母中得到了表达.     

高山被孢霉Δ6Ⅱ-脱饱和酶的克隆、表达和功能鉴定

产油微生物高山被孢霉中Δ6脱饱和酶是决定ω3/ω6脂肪酸代谢流的关键酶,该酶对不同底物的催化特性直接决定该菌体内脂肪酸的流向。在已完成基因组测序的高山被孢霉ATCC32222中经注释发现它存在两种Δ6脱饱和酶(Δ6-Ⅰ和Δ6-Ⅱ),选择对其中的Δ6-Ⅱ脱饱和酶进行克隆、表达和功能鉴定。首先以p YES2/NT C质粒为骨架构建了Δ6-Ⅱ脱饱和酶基因(FADS6-Ⅱ)的表达载体(p YES2/NT C-FADS6-Ⅱ),并转化至酿酒酵母中进行诱导表达,进一步通过在重组菌培养基中添加Δ6脱饱和酶的底物来考察Δ6-Ⅱ脱饱和酶对各底物的偏好作用。实验结果表明,在分别添加0.5 mmol/L亚油酸(LA)和0.5 mmol/Lα-亚麻酸(ALA)时,Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为42.94%,对ALA没有催化作用。而当底物添加方式改为同时添加LA和ALA时(分别为0.25 mmol/L),Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为37.12%,对ALA仍没有催化作用。该实验结果为高山被孢霉中Δ6-Ⅱ脱饱和酶的催化功能研究提供了理论依据。     

高山被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆、结构分析及其功能的研究

从高山被孢霉ATCC16266总DNA中扩增出大小为1374bp和1947bp的两条特异片段,序列分析表明后者在细胞色素b5和组氨酸Ⅰ之间含有一大小为573bp的内含子和两条分别为197bp和828bp的外显子,推导的氨基酸二级结构分析表明,该基因有两个长的跨膜疏水区和3个组氨酸保守区,分别根据D6D内含子及组氨酸Ⅱ区,Ⅲ区的序列设计引物,制备不同的探针与高山被孢霉的基因组杂交,证明在其基因组中确实存在两个△^6-脂肪酸脱氢酶基因,其中一个基因含有内含子,把不含有内含子的核基因MAGL6-1克隆到的酿酒酵母表达载体pYES2.0中,转化到酿酒酵母INVSc1中,对筛选得到的酵母工程菌株进行脂肪酸GC分析,检测到了γ-亚麻酸,说明克隆的D6D基因MAGL6-1能在酿酒酵母中进行功能性表达。     

海洋破囊壶菌Δ4-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒酵母中的表达

以质粒pGEM-TFAD4为模板，扩增获得1．6kb的△^4-脂肪酸脱饱和酶基因（FAD4）。将FAD4酶切后连接到hin dⅢ，Xba I处理过的pYEs2．0载体，构建重组表达质粒pYFAD4。转化酿酒酵母缺陷型菌INVScl，通过SC-U选择性培养基筛选阳性克隆子。添加外源脂肪酸C22：5底物，半乳糖诱导表达。气相色谱分析表明阳性克隆子总脂肪酸中出现了二十二碳六烯酸C22：6（占酵母总脂肪含量的41．13％），△^4-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒酵母中得到了表达。     

△~9-1,18-十八烯二元酸生产菌株的筛选和诱变

△~9—1,18-十八烯二元酸(△~9DC_(18))是合成名贵香料——灵猫香的重要原料。灵猫香是四种名贵动物香(龙涎香、麝香、灵猫香和海狸香)中的一种。由于人民生活水平的不断提高,对名贵香料的需求量与日俱增,又由于人类保护野生动物,所以名贵香料的供求关系日渐紧张,因此合成人造香料是一种发展方向。 △~9DC_(18)自然界中不存在,化学方法又无法合成,微生物具有一种特异的氧化能力,能在常温常压下发酵油酸或油醇,生成相应链长的二元酸而不破坏其双键结构,因此可用微生物方法生产△~9DC_(18)。1983年日本田冈映用假丝酵母(Candida)MD—105,从反式—△~9—十八碳脂肪酸和顺式—△~9—十八碳脂肪酸发酵生产,用休止细胞转化96h,前者产生反式—△~9—1,18—十八烯二元酸(反式△~9DC_(18))达到32.9g/L,后者产生顺式—△~9—1,18—十八烯二元酸(顺式△~9DC_(18))达到48.lg/L。本文报道生产△~9DC_(18)菌株的筛选和诱变。