高通量测序技术在细菌耐药中的应用

细菌耐药已成为威胁全球人类公共健康的重要因素之一,快速、准确明确细菌耐药的特性、机制及传播特征对疾病治疗及控制耐药菌的传播具有重要意义。高通量测序技术可以同时平行检测多个基因序列的状态,已广泛应用于细菌耐药检测。目前高通量测序技术在细菌耐药领域的应用主要有:全基因组测序技术、目标区域测序技术和宏基因组测序技术。所采用的测序平台主要为Illumina、Ion Torrent、BGI等二代测序和Pacific Biosciences、Oxford Nonopore 等三代测序平台。通过细菌耐药基因预测细菌耐药表型的准确性在很大程度上依赖于成熟的专业耐药基因数据库,各种通用型、特异型及隐马尔可夫模型耐药基因数据库的建立和完善,为高通量测序技术在细菌耐药领域的应用提供了坚实的基础。本文简要介绍了高通量测序技术、数据分析方法及相应测序平台在细菌耐药领域中的应用进展,并同时介绍了细菌耐药数据库的现状。     

致病菌基因组岛的研究进展

细菌基因组岛是细菌基因组上的特定区域,和水平基因转移相关,具有一定的结构特点,常携带致病、耐药及与适应性等功能相关的基因。通过基因组岛在细菌间的移动,可以造成相关基因在细菌间的传播,在细菌生存和致病等过程中具有重要作用。目前已经可通过生物信息和分子生物学实验等方法对基因组岛进行预测和验证。通过对致病菌基因组岛的研究,可以阐释细菌致病性和耐药等重要功能的获得,对疾病进行溯源,在传染病预防控制中具有重要意义。     

肠杆菌科细菌耐药基因表达的遗传和环境调控

细菌耐药性是21世纪国际关注的重要问题,也是全球面临的重大挑战。肠杆菌科细菌是医院感染的重要病原菌之一。近年来,随着抗生素的大量使用,多种肠杆菌科耐药菌,尤其是多重耐药肠杆菌开始大量出现,对人类健康形成了日益严重的威胁。细菌可以通过耐药基因突变或水平转移的方式获得耐药性,通常情况下,可以通过已知的耐药机制预测相应的耐药表型。然而,最近有研究表明,遗传背景和环境因素能够影响耐药基因的表达,给定的基因型并不一定总是产生预期的耐药表型。这种基因型-表型分离的现象极大程度上限制了从遗传学角度预测耐药表型的能力。文中结合最新文献,从遗传背景和环境条件两个方面探讨了多种肠杆菌科细菌耐药基因的表达调控机制,以期为遗传学预测耐药表型以及临床指导用药提供一定的支持。     

社区获得性ST59型MRSA HZW450的全基因组测序及分析

目的对1例脓疱疮患者脓液中分离的1株社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)HZW450菌株进行全基因组测序并对序列信息解析。方法使用三代测序PacBio技术对HZW450菌株进行全基因组测序,且使用SMRTanalysis v.R2.3.0对该序列进行序列拼接,上传NCBI进行基因功能注释,用RPSBLAST program进行直系同源簇(COG)注释以及毒力因子相关基因和耐药基因分析。同时比较国内其他地区发现的同一序列型(ST)的菌株毒力因子相关基因及耐药相关基因的差异,并比较HZW450菌株耐药基因型与表型的一致性。结果 HZW450菌株的基因组大小为2 831 958bp,GC占比32.9%,其基因组完成图序列已提交至NCBI GenBank数据库,登录号为CP020741。同时经过分析发现该菌株为ST59型,其基因组中含有许多与致病相关的毒力因子,以及含有耐药基因aph(3′)-III、ant(6)-Ia、mecA、norA、erm(B)和cat(pC233),毒力及耐药基因与ST59型其他菌株比较有差异。该菌株临床药敏结果与耐药基因比较分析发现,耐药表型与基因型存在差异。结论本研究报道了1株CA-MRSA(HZW450)菌株的全基因组序列。基因序列分析显示该菌株携带大量毒力基因,包括lukS-PV、lukF-PV、eta、fnbA、fnbB、sspB、sspC等,编码毒素、粘附、免疫逃逸等相关毒力因子,其毒力较强,致病性较高。     

耐药基因数据库概述

抗生素是人类历史上的革命性发现,其临床应用挽救了无数患者的生命。但是随着抗生素的广泛使用和滥用,越来越多的病原菌产生了耐药性,甚至出现了具有多重耐药性的“超级细菌”。在人类与病原菌斗争的军备竞赛中,人类即将面临无药可用的境地。针对微生物的耐药性、耐药机制及耐药性传播的研究吸引了众多科研工作者的目光,各种耐药基因数据库以及耐药基因分析工具应运而生。文中对目前耐药领域的基因数据库进行收集整理,从数据库类型、数据特征、耐药基因预测模型以及可分析序列的类型等方面对这些数据库进行论述和介绍。此外,文中对抗金属离子和抗杀菌剂的基因数据库也有所涉及,将为如何选择及使用耐药基因数据库提供参考和帮助。     

细菌固有耐药的研究进展

人们以往大多只关注由敏感细菌通过基因水平转移和自发突变方式获得的耐药性,而忽略了细菌对某类抗生素天然耐药的重要特性,细菌的这种特性又被称为固有耐药。固有耐药由固有耐药基因决定,这类基因是指存在于某类细菌染色体上位置保守的与耐药相关的一类基因。近年来,对固有耐药基因的研究已经越来越受到重视。固有耐药基因的发现不仅可以为新药研制提供药物作用靶标,而且通过阻断病原菌固有耐药基因还可使以往对该类菌不起作用的抗生素药物重新焕发抗菌活性。此外,已有研究表明固有耐药基因能够被移动元件捕获进而可水平转移至其他细菌,因此通过监测固有耐药基因可以预测耐药菌的出现。本文对传统的细菌固有耐药机制包括细胞膜的低渗透性和多药外排泵系统,以及已知重要病原菌的转移酶和代谢相关酶的固有耐药机制进行了介绍。同时,进一步对隐性固有耐药基因的特性进行了阐释,最后探讨了固有耐药与获得性耐药的进化关系,指出固有耐药基因很可能是一些获得性耐药基因的来源。     

基于序列相似性和Z曲线方法重注释原核生物蛋白编码基因

随着测序技术的不断发展,产生了海量的基因组测序数据,极大地丰富了公共遗传数据资源。同时为了应对大量基因组数据的产生,基因组比较和注释算法、工具不断更新,使得联合多种注释工具得到更准确的蛋白编码基因的注释信息成为可能。目前公共数据库的原核生物基因组测序和装配有些是10多年前的,存在大量预测的功能未知的编码基因。为了提升美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库中基因组的注释质量,本研究联合使用多种原核基因识别算法/软件和基因表达数据重注释1587个细菌和古细菌基因组。首先,利用Z曲线的33个变量从177个基因组原注释中识别获得3092个被过度注释为蛋白编码基因的序列;其次,通过同源比对为939个基因组中的4447个功能未知的蛋白编码基因注释上具体功能;最后,通过联合采用ZCURVE 3.0和Glimmer 3.02以及Prodigal这3种高精度的、广泛使用且基于算法不同而互补的基因识别软件来寻找漏注释基因。最终,从9个基因组中找到了2003个被漏注释的蛋白编码基因,这些基因属于多个蛋白质直系同源簇(clusters of orthologous groups of proteins, COG)。本研究使用新的工具并结合多组学数据重新注释早期测序的细菌和古细菌基因组,不仅为新测序菌株提供注释方法参考,而且这些重注释后得到的细菌基因序列也会对后续基础研究有所帮助。     

沙门氏菌泛耐药基因组特征分析

【目的】分析沙门氏菌的泛耐药基因组特征。【方法】以EnteroBase数据库中16365株沙门氏菌为对象,利用课题组自主研发的泛耐药基因组分析软件(PRAP),进行泛耐药基因组结构的鉴定,通过曼-惠特尼秩和检验和皮尔逊检验,来分析耐药基因与血清型、序列型(sequence type,ST)及分离株样本来源信息间的相关性。【结果】沙门氏菌共有104种耐药基因,其中核心耐药基因18种,附属耐药基因86种,且沙门氏菌拥有一个开放型的泛耐药基因组;相同的血清型(或ST型)有相似的耐药基因谱,不同血清型(或ST型)间耐药基因的分布差异显著(P0.05),耐药基因与样本来源、分离国家及年份间也存在一定的相关性;在测试的23种获得性耐药基因中,43.48%(10/23)的占比逐年升高,73.91%(17/23)以单一亚型为优势。【结论】利用PRAP软件分析获得的这些结果揭示了近年来沙门氏菌耐药基因的时空分布规律,为沙门氏菌等食源性致病菌耐药性的研究提供了新思路。     

大熊猫源细菌耐药性研究进展

耐药菌和耐药基因已成为一种新型环境污染物,引发世界公共卫生问题。细菌耐药性尤其是多重耐药菌在人医临床、畜禽养殖以及环境传播等多个方面得到越来越多的关注,而关于大熊猫等野生动物的耐药性研究相对较少。大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是世界公认的珍稀野生动物,其种群数量易受到各种疾病的威胁,尤其是肠道细菌性疾病。随着抗菌药物在疾病预防和控制中的普遍使用,由此带来的耐药性危害日益明显。本文总结了关于大熊猫源细菌耐药的国内外研究报道,对其耐药表型、耐药基因型、耐药机制及水平传播机制等方面内容进行了综述,旨在为大熊猫源细菌耐药性的研究和防控提供依据,为临床科学用药提供理论参考,从而助力大熊猫迁地保护。     

基于功能宏基因组学挖掘抗生素耐药基因研究进展北大核心CSCD

随着各类抗生素被广泛用于治疗细菌感染以及抗生素在临床上的大量使用,驱动了各类抗生素耐药基因的不断进化,导致了耐药问题日趋严重。耐药基因与耐药细菌的广泛传播与普遍流行严重威胁公共卫生体系并引起了巨大的经济损失。值得注意的是,抗生素的广泛施用不仅造成了动物体内耐药细菌的产生,还提高了对环境中微生物的选择压力,间接推动了耐药基因的发展与进化,使环境微生物成为耐药基因新的储库。因此对耐药细菌的广泛监测与新型耐药基因的提前发掘具有重要的临床意义与研究价值。但是传统的耐药性调查手段过度依赖对耐药细菌的培养,难以全面的展现固定生态位中微生物耐药性的全貌。而功能宏基因组学技术利用其表型筛选和高通量测序相结合的优势,不依赖于对携带目标基因的特定细菌的培养,因此在发掘新型功能基因方面有着巨大的优势。本文综述了功能宏基因组在抗生素耐药方面的研究进展,讨论了功能宏基因组学方法在检测新型基因研究中的意义及存在的问题,为后续深入开展对抗生素耐药机制的探究提供了坚实的理论基础。     

Identification of antibiotic resistance and virulence-encoding factors in Klebsiella pneumoniae by Raman spectroscopy and deep learning

Klebsiella pneumoniae has become the number one bacterial pathogen that causes high mortality in clinical settings worldwide. Clinical K. pneumoniae strains with carbapenem resistance and/or hypervirulent phenotypes cause higher mortality comparing with classical K. pneumoniae strains. Rapid differentiation of clinical K. pneumoniae with high resistance/hypervirulence from classical K. pneumoniae would allow us to develop rational and timely treatment plans. In this study, we developed a convolution neural network (CNN) as a prediction method using Raman spectra raw data for rapid identification of ARGs, hypervirulence-encoding factors and resistance phenotypes from K. pneumoniae strains. A total of 71 K. pneumoniae strains were included in this study. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of 15 commonly used antimicrobial agents on K. pneumoniae strains were determined. Seven thousand four hundred fifty-five spectra were obtained using the InVia Reflex confocal Raman microscope and used for deep learning-based and machine learning (ML) algorithms analyses. The quality of predictors was estimated in an independent data set. The results of antibiotic resistance and virulence-encoding factors identification showed that the CNN model not only simplified the classification system for Raman spectroscopy but also provided significantly higher accuracy to identify K. pneumoniae with high resistance and virulence when compared with the support vector machine (SVM) and logistic regression (LR) models. By back-testing the Raman-CNN platform on 71 K. pneumoniae strains, we found that Raman spectroscopy allows for highly accurate and rationally designed treatment plans against bacterial infections within hours. More importantly, this method could reduce healthcare costs and antibiotics misuse, limiting the development of antimicrobial resistance and improving patient outcomes.     

克雷伯氏菌属(Klebsiella)细菌比较基因组学分析揭示多复制子抗性质粒介导广泛的抗性基因传播

[目的] 研究克雷伯氏菌与多复制子抗性质粒间的关系,分析细菌携带多复制子质粒对抗生素环境的响应机制。[方法] 以2018-2020年分离的56株不同来源克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）分离株为研究对象,利用微量肉汤稀释法评估其多重耐药表型,对分离菌株进行全基因组测序（WGS）,通过细菌全基因组关联分析（BGWAS）技术和比较基因组学方法深入解析多复制子抗性质粒形成的机制。[结果] 耐药表型分析发现野生动物来源的菌株具有更广的耐药谱系,总体Klebsiella sp.对氨苄西林表现出很高的耐药率（80.36%）,尤其是马来穿山甲来源菌株对头孢类抗生素高度耐受,同时对氯霉素、左氧氟沙星和复方新诺明等药物耐受,基因组分析发现这些菌株携带了抗性质粒和更多的抗生素抗性基因。进一步对69个质粒序列分析,发现有28个质粒为多复制子质粒,主要携带bla_CTX-M-15、bla_CTX-M-14、bla_CTX-M-55、bla_OXA-1和bla_TEM-1等β-内酰胺酶基因。细菌携带质粒类型分析认为Klebsiella pneumoniae可能是多复制子质粒的重要宿主,质粒骨架与结构分析发现多复制子质粒多由2个或2个以上单个质粒融合而成,携带此类质粒的菌株不仅获得了更广的耐药表型,而且在全球传播扩散分布逐年增加,因此产生对抗生素环境更强的适应性。[结论] 多重耐药性细菌呈现的表型与携带的多复制子质粒有关,相比较下多复制子质粒比非多复制子质粒有更强的抗性基因携带能力,或许是细菌在强大的抗生素压力下产生的重要响应机制。本研究对于未来探索细菌抗性基因的传播扩散机制具有重要意义。     

Meta分析在细菌耐药性研究中的应用与展望

随着抗生素的大量不规范使用,细菌耐药性不断增强,导致耐药及多重耐药细菌的出现,严重威胁着人类健康。运用统计学方法对耐药性相关研究进行汇总与多元分析,有助于更好地了解全球细菌耐药性的流行与分布,明晰细菌耐药性形成规律与机制的共性问题。Meta分析是一种将多个同类型研究进行综合分析的统计学方法,已广泛应用于细菌耐药性的研究。本文简要描述了Meta分析的起源及基本流程,并采用文献计量的方法对2000-2020年关于Meta分析在细菌耐药性研究中的应用进行系统综述;进一步总结并阐述了Meta分析在细菌耐药性领域应用的成功案例和结论,而且对Meta分析方法在细菌耐药性领域中的进一步研究进行了展望,以期推动该方法在细菌耐药性研究中的应用,为耐药性问题的系统阐释和有效控制提供可靠的工具。     

细菌耐药影响肠道菌群及其宿主免疫调控

抗生素在养殖业、医疗业及制药业的广泛应用导致环境中的细菌耐药性日益严重,环境中的抗生素及耐药细菌一旦进入人体肠道,将破坏肠道菌群稳态,对人体健康造成威胁,而残存于饮食中的环境污染物则加剧了细菌耐药造成的人体健康影响。文中在总结大量文献的基础上,阐述了细菌耐药对人体和动物肠道菌群的影响机制及其相关的机体免疫调控,以环境中影响人体肠道菌群获得耐药性的来源作为切入点,阐述抗生素和耐药细菌进入人体肠道后对人体肠道菌群结构和耐药基因组成的影响,以及与人体免疫和免疫调节相关疾病之间的相关机制,并对今后的研究方向进行了展望。     

基于机器学习的药物-靶标相互作用预测*

近年来,随着计算机硬件、软件工具和数据丰度的不断突破,以机器学习为代表的人工智能技术在生物、基础医学和药学等领域的应用不断拓展和融合,极大地推动了这些领域的发展,尤其是药物研发领域的变革。其中,药物-靶标相互作用(drug-target interactions, DTI)的识别是药物研发领域中的重要难题和人工智能技术交叉融合的热门方向,研究人员在DTI预测方面做了大量的工作,构建了许多重要的数据库,开发或拓展了各类机器学习算法和工具软件。对基于机器学习的DTI预测的基本流程进行了介绍,并对利用机器学习预测DTI的研究进行了回顾,同时对不同的机器学习方法运用于DTI预测的优缺点进行了简单总结,以期对开发更加有效的预测算法和DTI预测的发展提供帮助。     

A new look at antibiotic resistance

Abstract Since the discovery of antibiotic resistance in clinically important microbes, attention has focused properly on the profound medical aspects of this problem. However, studies of antibiotic resistance are of great interest in their own right for studies of gene regulation, evolution, chromosome structure, etc.; several resistance genes in clinical isolates are components of classical 'operon' structures. The construction of cloning vectors and gene transfer systems, particularly for interspecies studies, rely heavily on the use of antibiotic resistance genes, since these phenotypes can be used to select for DNA transfer between microbes, plants, and animals. Studies of the role of resistance mechanisms and their genetic determinants in antibiotic-producing organisms have shown that these functions play important roles in biosynthetic pathways and can provide important genetic and biochemical tools for the rational analysis of antibiotic production.     

Chimeric dihydrofolate reductases display properties of modularity and biophysical diversity

While reverse genetics and functional genomics have long affirmed the role of individual mutations in determining protein function, there have been fewer studies addressing how large‐scale changes in protein sequences, such as in entire modular segments, influence protein function and evolution. Given how recombination can reassort protein sequences, these types of changes may play an underappreciated role in how novel protein functions evolve in nature. Such studies could aid our understanding of whether certain organismal phenotypes related to protein function—such as growth in the presence or absence of an antibiotic—are robust with respect to the identity of certain modular segments. In this study, we combine molecular genetics with biochemical and biophysical methods to gain a better understanding of protein modularity in dihydrofolate reductase (DHFR), an enzyme target of antibiotics also widely used as a model for protein evolution. We replace an integral α‐helical segment of Escherichia coli DHFR with segments from a number of different organisms (many nonmicrobial) and examine how these chimeric enzymes affect organismal phenotypes (e.g., resistance to an antibiotic) as well as biophysical properties of the enzyme (e.g., thermostability). We find that organismal phenotypes and enzyme properties are highly sensitive to the identity of DHFR modules, and that this chimeric approach can create enzymes with diverse biophysical characteristics.