定点突变Ca~(2+)平衡位点对粘质沙雷氏菌脂肪的影响

为了研究粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)脂肪酶lip A中的Ca~(2+)对酶活力的影响,采用定点突变的方法对平衡Ca~(2+)的位点D388进行定点突变,对突变体进行诱导表达后,纯化目的蛋白并进行酶学性质分析。与野生酶相比,突变酶的最适温度由40℃降低到25℃,最适p H值由8.5降到8.0,T_(1/2)值比野生酶提高了2℃。由此可知,该Ca~(2+)对脂肪酶lip A酶学性质有着至关重要的作用。     

产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧酶的异源表达及粗酶性质

赖氨酸脱羧酶,可以催化赖氨酸脱羧生成戊二胺。戊二胺是重要的平台化合物,可以合成新型聚酰胺材料、脂肪族异氰酸酯等新材料。本研究对来自于产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶进行异源表达。以pUC18质粒为载体,将来源于产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶基因ldc克隆到大肠杆菌,得到菌株LN18。在添加0.5 mmol/L IPTG的LB培养基中,对LN18进行摇瓶培养,发酵液酶活可达到35 U/g发酵液,从发酵液制备的赖氨酸脱羧酶粗酶蛋白的酶活可以达到30 000 U/g粗蛋白。产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧粗酶蛋白大小约80 kDa,粗酶的最适温度和pH值分别为55℃和5.5,与文献中报道的大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶Cad A在pH 8.0几乎没有酶活不同,产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶在pH 8.0的酶活达到最优pH下酶活的30%以上。金属离子对酶活有一定的影响,Mg~(2+)对酶活有促进作用,Fe~(2+)、Zn~(2+)、Ca~(2+)有一定的抑制作用。     

Ca~(2+)通过膜脂影响肌质网Ca~(2+)-ATP酶的活性与Ca~(2+)转运功能

重建在大豆磷脂脂质体上的兔骨骼肌肌质网Ca~(2+)—ATP酶在ATP驱动下可将溶液中的Ca~(2+)转运到脂酶体内部;外加EGTA则可除去脂酶体外部的Ca~(2+),由此可得到四种含Ca~(2+)状态不同的脂酶体:(1)内、外都无Ca~(2+);(2)仅外部有Ca~(2+);(3)内、外都有Ca~(2+);(4),仅内部有Ca~(2+).用DPH和AS系列萤光探针对这四种含Ca~+状态不同的脂酶体的膜脂流动性进行了测定,结果表明:脂酶体外部加入Ca~(2+),脂双层外表面的流动性降低.当Ca~(2+)进入脂酶体内部后,内表面膜脂的流动性也降低,而且外层膜脂流动性进一步降低.脂酶体内、外的Ca~(2+)含量不同时,Ca~(2+)—ATP酶功能状态也不同.转运到脂酶体内部的ca~(2+)积累到一定浓度后,通过Ca~(2+)泵向内转运的Ca~(2+)及Ca~(2+)—ATP酶活力都受到了抑制.转运进行到第四分钟时的酶活只有第一分钟的9%.但在相同的实验条件下,失去了完整的膜结构的纯化的Ca~(2+)—ATP酶蛋白没有被抑制.这提示完整的膜结构是这种抑制作用所必需的,而且膜两侧Ca~(2+)浓度的梯差可通过影响膜脂来调节Ca~(2+)—ATP酶的功能.     

卡门柏青霉-PG3脂肪酶的研究

从242株青霉属菌株中筛选出脂肪酶产生菌青霉-PG3。经鉴定,定名为卡门柏青霉(Penicillium camembertii Thom)。卡门柏青霉-PG3在由4％豆饼粉,0.5％糊精,0.75％橄榄油,0.5％K_2HPO_4,0.1％(NH_4)_2SO_4组成的液体培养基中,28℃,振荡培养96小时,发酵液脂肪酶活力(39℃,pH7.0)达60U/ml。PG3脂肪酶以橄榄油为底物,水解反应最适温度为48℃,最适pH为8.0。pH稳定范围6.0—11.0。Cu~(2+),Ca~(2+),Fe~(2+),Pb~(2+)等金属离子对酶活力有抑制作用。PG3脂肪酶对椰子油、菜籽油、亚麻油等油脂的水解率分别达到96％,94％和90％。     

羊骨酶解液的植物乳杆菌发酵

为进一步提高羊骨酶解液的营养价值和生物利用度,探讨乳酸菌发酵对钙离子释放、短肽形成以及酶解液抗氧化活性的影响。首先从7株乳酸菌中筛选出了产蛋白酶能力最强的植物乳杆菌,接种羊骨酶解液,以发酵液中Ca~(2+)浓度为指标,响应面法优化得到发酵工艺:酶解液中添加1%的麦芽糖,调节起始pH为5.5,以4%接种量接种驯化好的植物乳杆菌,37℃摇床发酵14 h。发酵过程中,植物乳杆菌活菌数与Ca~(2+)含量(R=0.495,P0.01)和短肽得率(R=0.655,P0.01)呈极显著正相关,而多肽生成量与短肽得率呈负相关(R=–0.013)。发酵液中的Ca~(2+)浓度(P0.05)、水解度(P0.01)、短肽得率(P0.01)、羟脯氨酸含量(P0.01)均显著高于酶解液(P0.01),植物乳杆菌活菌数达到94.6×10~8 CFU/m L。发酵还可使酶解液对DPPH、·OH、O_2~-·三种自由基的清除能力显著提高(P0.01,P0.05)。综上所述,以植物乳杆菌发酵羊骨酶解液可进一步促进骨钙的转化和胶原短肽的生成并显著提高其体外抗氧化能力,短肽和Ca~(2+)反过来促进植物乳杆菌的繁殖,增强了酶解液的益生功能,乳酸菌产生的维生素、胞外多糖等物质使羊骨酶解液更富营养。     

一株木蹄层孔菌SO3高产漆酶发酵工艺及部分酶学特性研究

从采自新疆阿勒泰山的木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)中筛选获得一株高产漆酶的SO3菌株,对其产酶发酵工艺进行优化,并对部分酶学特性进行了研究。结果表明:SO3菌株产漆酶的最佳碳、氮源分别为麦麸和酵母粉; Mn~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)和Mg~(2+)的添加对SO3产漆酶有一定的促进作用,而Cu~(2+)具有明显的抑制作用;没食子酸和单宁酸可使产酶高峰期提前2天;添加ABTS可使酶活由6 736 U/L提高至8 470 U/L;正交实验L_9(3~4)优化培养基最佳组分为:酵母粉0.5%、麦麸2.5%、葡萄糖0.5%,磷酸二氢铵0.5%,漆酶活性达到10 863 U/L。酶学特性结果表明:SO3菌漆酶最适反应温度为50℃,且在80℃仍具有漆酶活性,最适反应pH为3.0,在40℃,pH 4.0～5.0之间,酶活性最稳定;同时研究表明Mn~(2+)和Zn~(2+)对酶稳定性有一定的促进作用,Co~(2+)、Cd~(2+)、Cr~(2+)和Pb~(2+)对酶的稳定性具有明显的破坏作用;对菌体及发酵液进行了双向电泳检测,测定其等电点为4.1,获得了1个纯化酶蛋白质谱序列。结果表明,该蛋白为LaccaseE(Trametes sp.420)。SO3菌株具有潜在的应用价值。     

嗜热菌Anoxybacillus sp.产淀粉酶培养基优化及产酶条件研究

目的:对产淀粉酶嗜热菌Anoxybacillus sp.菌株进行培养基优化及产酶条件研究,以便提高菌株的产酶能力,并为下一步菌株的诱变育种研究提供基础。方法:常规方法液体培养菌株,用平板初筛和DNS法复筛选择产淀粉酶能力较高的菌株;单因素筛选培养基最适的碳源、氮源、Ca~(2+)浓度和Mg~(2+)浓度,对单因素筛选的最佳碳源、氮源、Ca~(2+)和Mg~(2+)的三个较佳浓度进行四因素三水平正交试验优化培养基;对培养基不同p H值及不同培养温度进行培养条件研究。结果:产淀粉酶菌株筛选结果显示:六株菌中淀粉酶酶活力值最大的是菌株DL4,差异有统计学意义(P0.05)。培养基单因素筛选结果显示:最适碳源为麦芽糖、最适氮源为硝酸铵、最适Ca~(2+)、Mg~(2+)浓度均为0.02%,差异有统计学意义(P0.05)。培养基优化结果显示:C源0.1%,N源0.2%,Mg~(2+)0.04%,Ca~(2+)0.04%为最佳的培养基成分组合。产酶条件筛选结果显示:培养基p H值为6、培养温度为55℃时菌株产酶水平最高,差异有统计学意义(P0.05)。结论:培养基的优化及最适的产酶条件能提高嗜热菌Anoxybacillus sp.DL4产淀粉酶能力,Ca~(2+)、Mg~(2+)离子对菌株产淀粉酶有促进作用。     

类产碱假单胞菌耐热碱性脂肪酶的研究

从福建省福州市温泉澡堂污水浸润土壤中分离筛选到一株耐热碱性脂肪酶产生菌——类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)F331。产酶最适条件为:碳源小麦粉,氮源豆饼粉,起始培养pH9.4～9.5,培养温度24～26℃,培养周期32～34h。经硫酸铵盐析、Sepharose 4B和Sephadex G-200柱层析得到纯化的酶组分。该酶最适作用温度50℃,最适作用pH 10.0,60℃保温80min酶活基本不损失,在pH 7.0～10.0范围内酶蛋白稳定:Ca~(2+)和Mg~(2+)对酶有激活作用,Pb~(2+).Zn~(2+)、Fe~(2+)和Co~(2+)对酶活有抑制作用。该酶分子量45700。     

用快中子法选育细菌脂肪酶高产菌株

研究了从土壤中筛选产脂肪酶的菌株,利用紫外线,快中子,快中子和磁场复合,γ射线,γ射线和磁场复合诱变,以酶活为筛子进行诱变育种,结果,出发菌酶活较低的一株得到了一株酶活为396．22U/mL的诱变株,此酶活比出发菌株高92倍,并发现比菌对紫外线和快中子比较敏感,而出发菌酶活较高的一株得到了酶活为424．60U/mL发酵液的诱变株,此酶活为出发菌株3．0倍,在此基础上,初步探讨了快中子,γ射线及磁场复合处理在产脂肪酶菌种诱变中的作用,并认为,在产脂肪酶菌株的诱变中快中子诱变更为有效。     

跨膜Ca~(2+)梯度对肌质网Ca~3+-ATP酶调节的特异性

我们曾报道跨膜Ca~(2+)梯度可通过膜脂影响肌质网Ca~(2+)-ATP 酶的构象和活性。本文就跨膜Ca~(2+)梯度对肌质网Ca~(2+)-ATP 酶的调节是否具有特异性作进一步研究。结果表明这种特异性表现在两方面:一是跨膜Ca~(2+)梯度对肌质网Ca~(2+)-ATP 酶功能的调节不能归结于跨膜Ca~(2+)浓度梯度所导致的膜电位的作用,离子载体FCCP 可消除跨膜电位但并不影响肌质网Ca~(2+)-ATP 酶的活力;二是其它二价金属离子如Sr~(2+)的跨膜梯度对肌质网Ca~(2+)-ATP 酶活力基本无影响。荧光偏振系列探剂n-AS 测定的结果表明跨膜Ca~(2+)与Sr~(2+)梯度对嵌有Ca~(2+)-ATP 酶的脂酶体的中部流动性的影响有较大差异。而Ca~(2+)-ATP 酶的Ca~(2+)结合位点正处于脂双层中部,这进一步提示膜脂参与了跨膜Ca~(2+)梯度对Ca~(2+)-ATP 酶的调节作用。     

一株耐热脂肪酶产生菌的筛选及酶学性质研究

从云南省富油地采取了60份土样中,利用透明圈法筛选出一株耐热脂肪酶产生菌。对其酶学性质和发酵条件进行了研究,酶学性质表明,该酶最适作用温度为50℃,最适pH6.0,在pH3.0-8.0范围内稳定,在60℃保温60 min酶活还保留70%;70℃保温60 min残余50%;具有良好的热稳定性;不同金属离子有不同的作用,Ca+,K+对酶有激活作用,Fe3+、Pb2+、Mn2、Cu2+、Al3+、Zn2+对酶活有抑制作用。EDTA对酶影响不大。产酶最佳条件为:MgSO4.7H2O 0.05 g,K2HPO40.1 g,CaCO30.25 g,可溶性淀粉2.5 g,大豆粉2.5 g,装液量50 mL。这株细菌通过培养基优化酶活达到20.3 U/mL。     

1株高效降解纤维素的槲寄生内生真菌研究

利用刚果红-CMC平板染色法、DNS法从槲寄生内生真菌中筛选获得1株高效纤维素酶产生菌H-3-3,通过分析其菌落形态特征和18S rDNA序列的同源性,将菌株H-3-3鉴定为拟茎点霉属Phom opsissp.;对其酶学性质研究得到：槲寄生内生真菌H-3-3中CMC酶、β-葡糖苷酶、滤纸酶这3种组分酶最适温度均为50℃,β-葡糖苷酶活和滤纸酶活最适pH值均为4.8,CMC酶最适pH值为4.4;3种酶在30～45℃,pH4.0～8.0稳定性较强。金属离子Mn^2＋、Co^2＋、Mg^2＋和Ca^2＋对3组分酶都有不同程度的促进作用,其中以Co^2＋效果最佳;而Ba^2＋、Zn^2＋、Cu^2＋对3组分酶分均表现出明显的抑制作用。     

盐胁迫下刺槐无性系生长和矿质营养平衡研究

以一年生盆栽刺槐无性系BH327和B56为材料,对盐胁迫下刺槐无性系生长和矿质营养平衡进行了研究。结果表明：盐胁迫下BH56生长受抑不明显,组织水平上K^＋、Ca^2＋、Mg^2＋保持较高水平,尤其是在高盐下上部叶片足Ca^2＋、Mg^2＋的选择性吸收增强;而BH327,的生长受盐胁迫明显的抑制,组织水平上K^＋、Ca^2＋、Mg^2-水平相对较低,在高盐下上部叶片对Ca^2-、Mg^2＋的选择性吸收能力低于BH56。同时,从体内离子分配及选择性运输角度讨论了各无性系盐伤害或耐盐的原因。     

产γ-氨基丁酸屎肠球菌的鉴定及其谷氨酸脱羧酶酶学性质

目的:鉴定1株产γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的乳酸菌HS3,并研究了其谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)粗酶酶学性质。方法:根据形态培养特征、生理生化特征和16S rDNA序列比对及系统发育分析对菌株HS3进行了鉴定。采用菌体细胞破碎后的粗酶液,研究了温度、pH和金属离子对酶活的影响。结果:菌株HS3的形态培养和生理生化特征符合肠球菌属(Enterococcus)特征,其16S rDNA序列与Enterococcus faecium(EU717962)16S rDNA序列同源性达99%,鉴定菌株HS3为屎肠球菌(Enterococcus faecium),菌株HS3 GAD最适作用温度为40℃,最适作用pH4.5。酶的热稳定较好,50℃处理4h,在pH3.5～6.0酶活基本稳定。Ca2+对酶有激活作用,5mmol/L和50mmol/L浓度酶活分别提高了37.41%和17.43%。Ba2+和Zn2+在5mmol/L浓度时激活作用明显,而Mg2+在5mmol/L浓度激活作用较好。结论:菌株HS3的GAD活力较高,稳定性较好,为生物合成GABA提供了新的微生物菌种资源。     

不同类型水稻不育系药隔发育过程中Ca2+的分布变化

采用焦锑酸钾沉淀法研究了不同类型水稻不育系与其相应保持系及其可育花药药隔发育过程中Ca^2＋的分布变化。结果显示在正常花药的发育过程中,药隔中的Ca^2＋呈以下变化规律：（1）花药发育早期药隔中的Ca^2＋沉淀很少;（2）随着花药的发育,药隔中的Ca^2＋沉淀增加,木质部细胞的次生加厚壁上有较多的Ca^2＋沉淀,连接组织中的Ca^2＋沉淀也大大增加;（3）到了花粉内容物充实后期及成熟花粉时期,药隔中的Ca^2＋又略有减少。而不育花药药隔中的Ca^2＋在花药发育的各时期均比可育花药要多。败育类型不同,药隔中出现大量Ca^2＋沉淀的时期也不同,无花粉型不育系在花粉母细胞时期药隔中就有大量Ca^2＋沉淀,而农垦58S从单核花粉时期约隔中才出现大量Ca^2＋沉淀。实验结果表明：Ca^2＋在不同类型的不育水稻中呈现出一定的规律性变化,药隔中Ca^2＋的异常分布可能与水稻花粉的败育有关。     

Actin Dynamics Regulates Voltage-Dependent Calcium-Permeable Channels of the Vicia faba Guard Cell Plasma Membrane

Free cytosolic Ca~(2+) ([Ca~(2+)]_(cyt)) is an ubiquitous second messenger in plant cell signaling, and [Ca~(2+)]_(cyt) elevation is associated with Ca~(2+)-permeable channels in the plasma membrane and endomembranes regulated by a wide range of stimuli. However, knowledge regarding Ca~(2+) channels and their regulation remains limited in planta. A type of voltage-dependent Ca~(2+)-permeable channel was identified and characterized for the Vicia faba L. guard cell plasma membrane by using patch-clamp techniques. These channels are permeable to both Ba~(2+) and Ca~(2+), and their activities can be inhibited by micromolar Gd~(3+). The unitary conductance and the reversal potential of the channels depend on the Ca~(2+) or Ba~(2+) gradients across the plasma membrane. The inward whole-cell Ca~(2+) (Ba~(2+)) current, as well as the unitary current amplitude and NP. of the single Ca~(2+) channel, increase along with the membrane hyperpolarization. Pharmacological experiments suggest that actin dynamics may serve as an upstream regulator of this type of calcium channel of the guard cell plasma membrane. Cytochalasin D, an actin polymerization blocker, activated the NP_o of these channels at the single channel level and increased the current amplitude at the whole-cell level. But these channel activations and current increments could be restrained by pretreatment with an F-actin stabilizer, phalloidin. The potential physiological significance of this regulatory mechanism is also discussed.     

磷脂酶A2在诱导红豆杉细胞产生活性氧中的作用

对磷脂酶A2(PLA2)在真菌诱导中国红豆杉细胞产生活性氧中的作用进行研究,结果表明：PLA2非特异抑制剂可降低真菌诱导子诱导产生的H2O22通过钙离子螯合和PLA2特异抑制剂实验,表明参与H2O2产生的PLA2为胞质CaO^2 依赖型2对PLA2诱导H202产生的机理进行分析,发现亚油酸可缓解PLA2抑制剂对诱导的活性氧的抑制作用,而且亚油酸单独处理可导致H2O2的发生,其它的脂肪酸也具有类似诱导H2O2发生的作用.不同离子型的脂肪酸对H2O2产生的影响不同,阴离子型脂肪酸较非离子型脂肪酸更能促进活性氧的发生.这些结果表明,PLA2可能通过产生脂肪酸或其衍生物激活H2O2的产生酶系.     

红光对绿豆下胚轴线粒体Ca~(2+)积累、ATPase及NAD激酶活性的影响

绿豆下胚轴切段经红光处理后10min,其线粒体的Ca~(2+)积累下降15％,Ca~(2+)-ATPase 及 Mg~(2+)-ATPase活性也分别下降29％和10％,切段CaM含量增加近1倍。Ca~(2+)存在时,红光能促进线粒体NAD 激酶活性。说明Ca~(2+)-ATPase及一部分Mg~(2+)-ATPase可作为钙泵控制Ca~(2+)进入线粒体。     

A23187和EGTA对光周期诱导菊花成花及其过程中叶片Ca2+分布和碳水化合物的影响

以切花菊品种‘神马’为试材,研究光周期诱导菊花成花过程中Ca²⁺载体A23187和Ca²⁺螯合剂EGTA处理对花芽分化及其过程中叶片Ca²⁺分布和蔗糖、可溶性糖及淀粉含量变化的影响.结果表明：对照叶片Ca²⁺含量在花芽未分化期（Ⅰ）处于较低水平,而在花芽分化启动期（Ⅱ）迅速增加并达到高峰,之后下降;Ca²⁺亚细胞定位表明,在未分化期（Ⅰ）Ca²⁺沉淀主要分布在液泡、细胞壁和细胞间隙中,细胞质内较少,而在花芽分化启动期（Ⅱ）细胞质内积累大量的Ca²⁺沉淀.A23187处理的菊花花芽分化开始和结束时间比对照分别提前2 d和3 d,叶片Ca²⁺含量比对照显著增加;EGTA处理的叶片Ca²⁺含量比对照显著减少,花芽分化开始和结束时间分别比对照推迟4 d和8 d;A23187和EGTA处理的叶片Ca²⁺在花芽分化启动期（Ⅱ）均向细胞质流入并密集.A23187处理的蔗糖和可溶性糖含量在处理2 d时达到峰值,比对照达到峰值的时间提前2 d,与Ca²⁺达到峰值的时间一致,而EGTA处理的蔗糖和可溶性糖含量在处理2 d时没有明显变化,8 d时才迅速增加达到峰值,即所有处理的蔗糖、可溶性总糖含量在花芽分化启动期（Ⅱ）均增加并达到高峰,之后有所减少,但其在整个花芽分化过程均高于光周期诱导前的含量;对照和A23187处理的淀粉含量在处理2 d时开始减少,而EGTA则在处理8 d后开始减少,至花芽分化结束所有处理的淀粉含量均保持较低水平（低于诱导前）.表明Ca²⁺碳水化合物参与了光周期诱导的菊花成花过程.