伪狂犬病病毒鄂A株TK－／gG－／LacZ＋突变株的构建

为了以国内地方分离株鄂A株为亲本构建伪狂犬病病毒双基因缺失株,采用外切酶Ⅲ和绿豆核酸酶酶切,构建了缺失主要毒力基因TK基因部分编码区的重组质粒pSTK1-4,进一步改造成为转移质粒pUCPB4。用HindⅢ将质粒pUCPB4线性化,然后与用EcoRI消化的伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/LacZ^ 突变株基因组DNA共转染PK－15细胞,等完全病变后,收毒作空斑试验,PCR筛选TK缺失的重组病毒。重组病毒空斑纯化3次,随机挑取空斑进行PCR扩增,证实所获得的病毒为均一的无TK^-/LacZ^ 突变株污染的TK缺失的重组病毒,分别以TK缺失株病毒与鄂A野毒株为模板对TK基因进行PCR扩增,扩增产物经酶切分析和测序后发现：TK缺失重组病毒的TK基因缺失了205个碱基,XhoⅠ和SalⅠ位点消失,SmaⅠ酶切片段发生变化,两种病毒在PK－15细胞上形成空斑的大小和增殖 滴度无明显的差别。进一步提取TK缺失突变株基因组DNA,与含gG-LacZ的转移质粒pUSKZ通过磷酸钙法共转染PK－15细胞,待完全病变后,在X-gal存在下筛选蓝斑,将桃取的蓝斑纯化3次后,对纯化的重组病毒进行TK、LacZ扩增,结果既能扩增出较以鄂A野毒株为模板扩增的要小的TK基因片段,同时又能扩增出LacZ基因,证实所得到的重组病毒为TK^-/gG^-/LacZ^ 突变株。此双缺失突变株的构建成功,为在我国最终根除伪狂犬病提供了有用的工具。     

伪狂犬病病毒TK-/gG-缺失株的构建及其生物学特性研究

将伪狂犬病病毒TK^-／gG^-／LacZ^ 突变株的基因组DNA与含有缺失的gG基因的转移质粒pUSKBB共转染猪肾传代细胞PK-15,待完全病变后收获病毒进行空斑试验,用PCR筛选gG缺失的重组病毒。空斑纯化3次后,随机挑取空斑进行PCR扩增,证实所获得的病毒为均一的TK^-／gG^-缺失株。遗传稳定性试验表明该重组病毒能在PK-15细胞上稳定遗传,动物试验表明该缺失株对Balb／c小鼠极为安全且能保护Balb／c小鼠抵抗致死量PRV强毒的攻击。该突变株的获得为我国伪狂犬病的控制和根除奠定了基础。     

脊髓灰质炎病毒Sabin株减毒的遗传学基础的研究进展

用Ｓａｂｉｎ株生产的口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（ＯＰＶ）由１、２、３型组成,疫苗株是由强毒株经连续传代突变而来,对每种疫苗株而言只有少数位点与减毒有关,特别是５′端非编码区的第５个茎 环结构。现已证实Ｓａｂｉｎ株病毒在人体中复制时由于病毒的回复突变或第２位点的抑制突变导致毒力回升,可能在疫苗接种者和接触者中引发脊髓灰质炎病例。用聚合酶链式反应和限制性内切酶酶切技术作突变分析（ＭＡＰＲＥＣ）对疫苗中的痕量回复突变进行定量分析已成为可能,正逐步用于从分子水平监测ＯＰＶ生产的连续性,成为评价３型ＯＰＶ质量的一个重要指标。     

中国脊髓灰质炎病毒疫苗株基因特征及其神经毒力的初步观察

中国脊髓灰质炎病毒疫苗株普遍存在基因变异的现象,如重组,点突变等。我们选出１０株有代表性的变异株,在具有人脊灰病毒受体基因的转基因小鼠ＰＶＲ－Ｔｇ２１中做毒力分析,发现Ｓａｂｉｎ １基因型与野毒基因型的重组株显示很强的神经毒力,其ＰＤ５０ｉｎＴＣＩＤ５０值为４．５,而Ｓｂｉｎ１标准株的ＰＤ５０值大于８０。另外两株Ｉ型疫苗株只有关键性核苷酸位点发生突变,只在位点５２５－发生突变的一株,其ＰＤ５０值为     

细胞适应性流感病毒高产株的制备研究

与鸡胚培养制备的流感疫苗相比,细胞制备的疫苗具有免疫原性好、生产不受鸡胚限制等优点。但目前流感病毒株在细胞上产量较低,成为疫苗生产的主要限制因素。现就用于制备细胞适应性高产株主要的3种方法,即连续传代、随机突变构建病毒突变体和病毒重配的研究进展,以及突变位点对病毒增殖的影响作一概述。     

Ⅰ型牛疱疹病毒TK-/gE-基因双缺失突变株生物学特性

目的构建Ⅰ型牛疱疹病毒（BHV-1）的TK-/gE-双缺失突变株,检测其生物学功能,为治疗牛传染性鼻气管炎提供参考。方法构建了带有EGFP表达盒的BHV-1 TK-/gE-双缺失突变株。通过southern杂交、蛋白质斑点印迹、空斑试验、MDBK细胞增殖实验等技术方法,对重组基因所构成病毒突变株的生物学特性进行鉴定。结果 Southern杂交及蛋白斑点印迹表明,课题组成功构建了带有EGFP表达盒的双缺失突变株;该突变株具有与野生株相当的繁殖力,但TK-/gE-成功缺失,毒力大幅减弱;BHV-1 TK-/gE-遗传稳定,不会返强。结论本项目组成功构建了Ⅰ型牛疱疹病毒（BHV-1）的TK-/gE-双缺失突变株,该缺失株具有良好的安全性和稳定性,为该突变株进一步作为生物安全疫苗和多价病毒载体提供了依据,为预防和治疗牛传染性鼻气管炎提供了技术支持。     

急性弛缓性麻痹病例中Ⅱ型脊髓灰质炎疫苗病毒变异株基因特征分析

研究Ⅱ型脊髓灰质炎(脊灰)疫苗变异株的基因特征,为我国使用口服脊灰减毒活疫苗/脊灰灭活疫苗使用策略,维持无脊灰状态和全球最终消灭脊灰提供科学依据。根据型内鉴定的检测结果,从2000~2001年AFP病例分离到的Ⅱ型脊灰疫苗变异株中选取有聚集性的5株病毒进行全基因组序列测定(贵州省3株、山东省2株),并进行核苷酸、氨基酸同源性分析。贵州省3株病毒全基因组序列完全一致,但与SabinⅢ型病毒发生重组,重组区域在3A区(nt5343~5353);与疫苗株相比,Ⅱ型区域变异10个碱基,其中VP1区变异4个,与SabinⅡ型株核苷酸同源性为99·56%,氨基酸同源性99·34%;Ⅲ型区域变异9个碱基。山东省2株病毒全基因序列共享16个突变位点,没有发生重组,与SabinⅡ型株相比,VP1区分别变异7个和4个碱基,核苷酸同源性分别为99·22%和99·56%,氨基酸同源性分别为99·0%和99·67%。上述5株病毒在重要的减毒位点nt481、nt2909均发生突变。此研究中5株病毒分属于两个不同的传播链,但是共享nt481、nt2909、nt2992三个突变位点,这3个突变位点不在重组区域内,他们的共同作用可能是影响病毒传播力的重要因素,但目前尚无证据证明脊灰疫苗病毒型间重组会增加病毒的毒力及传播力。     

新型冠状病毒突变株Omicron核酸检测的TaqMan探针设计

Omicron（奥密克戎）作为最新的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）突变株，其带有大量的突变位点，且突变位点主要位于S蛋白上，这不仅会增加再次感染病毒的风险，同时也会大幅降低疫苗和抗体疗法的的效果。Omicron携带的突变虽不影响国内现使用的核酸检测试剂，但这些检测试剂不能有效地鉴别出Omicron突变株。本研究通过对Omicron以及其他SARS-CoV-2突变株的基因序列进行分析，设计了能特异性检测Omicron突变株的TaqMan探针。同时，该探针可与现有的核酸检测体系进行结合，实现SARS-CoV-2核酸检测和Omicron突变株鉴别的双重功能。     

乳糖发酵短杆菌色氨酸营养缺陷株的诱变*

用亚硝基胍(NTG)诱变乳糖发酵短杆菌(Breevibacterium lactofermentum)ATCC-13869得到34株氨基酸营养缺陷突变株。经添加生物合成代谢途径中的不同底物鉴定,突变株33为色氨酸酶基因(tnA)缺陷,突变株34为色氨酸合成酶基因(trpB trpA)缺陷。     

全球新型冠状病毒变异株研究进展

截至2021年5月11日,基于Pango命名法,依据新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的基因组变异变迁将其划分为1281种亚型或分支.而SARS-CoV-2刺突(spike,S)蛋白的变异直接影响病毒的生物学功能.2020年下半年至今,全球多个国家和地区监测发现SARS-CoV-2的S蛋白发生氨基酸突变,特别是受体结合区或单克隆抗体结合位点氨基酸突变引起病毒的传播力和致病力改变以及部分免疫逃逸等.世界卫生组织将重要变异株划分为"关切变异株(variant of concern,VOC)"和"关注变异株(variant of interest,VOI)".其中,VOC 有4个,分别是 VOC 202012/01、501Y.V2﹑P.1 和 B.1.617;VOI 有6个,分别是 CAL.20C、P.2、B.1.526、B.1.525、B.1.616和P.3.一些氨基酸突变在多个VOC和VOI病毒株中交叉出现或同时出现,E484K/Q等重要氨基酸突变引起的部分免疫逃逸导致全球现有疫苗免疫效力下降,但现有新冠疫苗对VOC和VOI变异株仍然有效.本文通过对SARS-CoV-2变异株流行概况及S蛋白重要氨基酸突变特征进行归纳分析,为新冠病毒变异株的监测、防控和二代疫苗的研制策略提供科学参考.     

脑膜炎大肠杆菌K1株ppk1基因致病机制初探

【目的】构建脑膜炎大肠杆菌K1(Escherichia coli,E.coli K1)株E44的聚磷酸盐激酶1(Polyphosphate kinase 1,PPK1)基因敲除株,并对其生物学功能进行初步研究,为明确ppk1基因在E.coli K1株致脑膜炎机制中的作用奠定基础。【方法】利用自杀质粒pCVD442及基因同源重组技术敲除E.coli K1株E44中的ppk1基因,构建ppk1缺失突变株Δppk1;体外比较野生株和突变株在低营养及氧化压力情况下的生存能力;考察二者对人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells,HBMEC)的黏附能力;通过测定乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)释放活性,比较野生株和突变株对HBMEC的损伤效应。【结果】PCR及序列分析证实,突变株缺失全长ppk1基因。与野生株E44相比,ppk1突变株Δppk1在低营养环境中和氧化刺激条件下的生存能力明显降低。相对于E44,Δppk1对HBMEC的黏附能力减弱。与HBMEC孵育后,突变株孵育组HBMEC的LDH释放活性明显低于野生株孵育组。【结论】ppk1对E.coli K1株E44在低营养环境中的生存、抵抗氧化压力,以及黏附HBMEC和对细胞的毒性损伤有重要作用。     

禽病原性大肠杆菌aes-31基因突变株的构建和致病性鉴定

【目的】通过禽病原性大肠杆菌(APEC)aes-31突变株的构建和动物实验来初步鉴定此基因片段对E058株的毒力影响。【方法】对在芯片杂交试验中筛选到的APEC E058株体外表达差异基因片段aes-31(来自SSH方法筛选到的E058株特异片段),用SSH引物从重组质粒中扩增出目的片段,克隆到pGEM-Teasy Vector中,然后用SphⅠ和SpeⅠ从中切下此片段,将之克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建自杀性重组质粒pMEG375-aes-31,将突变载体转化到受体菌中,再和APEC E058株进行固相杂交,根据同源重组原理,筛选出基因突变株E058(Δaes-31)。【结果】E058株和突变株的LD50没有明显差别,突变株对35日龄SPF鸡的致死率高于E058株;两者接种鸡6 h内,E058(Δaes-31)突变株在各内脏器官和血液中的细菌数和E058株差异均不显著;接种鸡24 h后,E058(Δaes-31)突变株在脾脏和肺中的细菌数显著大于E058株,差异显著,E058(Δaes-31)突变株在心脏、肝脏和血液中细菌数显著大于E058株,差异极显著;接种鸡48 h后,E058(Δaes-31)突变株在心脏、肝脏和脾脏中的细菌数比E058株多,差异极显著,而肺脏和血液中的细菌数均无明显差异;48 h后突变株所引起的感染鸡的大肠杆菌病变比亲本株稍严重。【结论】以上数据表明aes-31有可能与E058株毒力的负调控有关。     

海南省三亚市15例新冠病毒Omicron变异株BA.5.1.3亚型的基因组特征分析

本文选取15例SARS-CoV-2感染病例的鼻咽拭子样本,采用新冠病毒全基因组三代Nanopore测序技术进行全基因组测序并对病毒的变异位点进行分析;结果显示,15株病毒均为BA.5.1.3变异株（Omicron）,NextStrain进化分析为22B。15株毒株共同发现了71个核苷酸突变位点,氨基酸的变异位点有54个,其中存在相同的16个同义突变。15株毒株具有5个特有的核苷酸变异,4个特有的氨基酸变异位点,个别毒株还具有其他突变位点。这是中国境内首次发现Omicron BA.5.1.3变异株,此变异株存在引发本地的流行和暴发风险,需要严密持续的对境外输入病例进行流行病学调查和病毒基因分子特征分析。本研究构建测序方法和分析结果可用于新冠病毒的变异分析和病例溯源,对新冠疫情防控具有重要意义。     

非复制型痘苗病毒的生物学性状研究进展

痘病毒被广泛用于针对多种感染性疾病和癌症的疫苗研究,而非复制型痘苗病毒的发展又进一步提高了其安全性。来源于中国天花疫苗株的复制缺陷型痘苗病毒天坛株(NTV)正是一株非复制型痘苗病毒。为了促进未来NTV作为疫苗候选株在临床中的应用,我们对NTV与另外2株非复制型痘苗病毒,即改良痘苗病毒安卡拉株(MVA)和NYVAC的生物学性状做简要综述,主要讨论了它们的基因组结构、体外生长特性、病毒复制和形态发生、组织中的病毒分布和病毒-宿主细胞间的相互作用。     

季节性流感病毒H1N1 BALB/c鼠肺适应株的建立及其分子机制

目的建立季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株,并对适应的分子机理进行研究。方法以病毒滴鼻感染小鼠,通过在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,观察小鼠存活情况及肺病理改变,来获得季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株。结果季节性流感H1N1 A/Brisbane/59/2007病毒野生型毒株,经过在小鼠体内进行8次传代后,毒力逐渐增强,从无致病力到致死率达到100%,对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对,发现适应株HA基因发生了3个有义突变。结论野生季节性低致病力H1N1流感病毒可经在小鼠中经过多次传代而获得高致病力H1N1鼠肺适应株,HA蛋白89位Thr至Ile的突变对毒力的增强起决定性作用。     

我国登革3型病毒广西80-2株基因组全序列分析

对我国登革 3型病毒 80 2株基因组进行全序列测定 ,为了解其基因组结构与功能的关系提供依据 .根据登革 3型病毒H87株的序列设计并合成引物 ,应用RT PCR和RACE法 ,对 80 2株基因组RNA进行扩增、克隆测序后获得我国登革 3型病毒广西株基因组序列 .该株病毒基因组全长10 696nt ,不含poly(A)尾 ,4种碱基数分别为A :3 4 3 7,C :2 2 15,G :2 773 ,U :2 2 71.包含一个读码框架 ,自 95至 10 2 67位 ,共 10 170个碱基 ,编码 3 3 90个氨基酸 ,5′和 3′非编码区长度分别为 94nt和4 3 2nt.与H 87株比较 ,核苷酸和氨基酸序列同源性均在 99%以上 ,有 2 8个碱基发生改变 ,其中 2 6个碱基突变发生在读码框架内 ,碱基转换 18个 ,颠换 10个 ;碱基突变引起 14个氨基酸的改变 .80 2株与H87株病毒的基因组全序列同源性高 ,变异度小 .     

猪链球菌cAMP结合蛋白基因敲除株的构建及生物学特性

目的:构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33 c AMP结合蛋白(CRP)编码基因敲除突变株及基因回复互补株,并探究CRP基因的缺失对细菌生物学特性及毒力的影响。方法:构建中间为壮观霉素抗性基因(Spcr)、两侧为CRP编码基因上下游同源序列的基因敲除质粒,通过同源重组筛选CRP编码基因敲除突变株ΔCRP;构建CRP编码基因的互补质粒,通过电转化敲除株ΔCRP,筛选CRP的基因回复互补株CΔCRP;比较分析突变株、野生株和回复互补株的基本生物学特征的差异,并以小鼠作为动物感染模型对突变株、互补株及野生株的毒力进行评估分析。结果:应用组合PCR和基因测序分析,证实构建了CRP的突变株ΔCRP,并筛选出CRP的回复互补株CΔCRP;逆转录PCR证实在突变株ΔCRP中CRP在转录水平缺失,而在回复互补株CΔCRP中其转录回复;在丰富营养情况下,突变株ΔCRP与野生株的溶血活性、生长速率及对小鼠的致病力均无显著性差异,但突变株的成链能力减弱。结论:CRP编码基因的缺失并未显著改变野毒株05ZYH33的基本生物学特性和毒力,提示CRP可能不是猪链球菌的关键毒力决定因子,其参与碳源代谢等功能有待进一步研究。     

酵母海藻糖酶缺失突变株的构建及其耐性

[目的]构建酵母海藻糖酶缺失突变株,并进行耐性分析,进一步研究海藻糖与酵母耐性之间的关系,为商业生产打下一定的基础.[方法]利用同源重组的方法,敲除了编码酸性海藻糖酶的ATH1基因和中性海藻糖酶的NTH1基因,构建了酸性海藻糖酶缺失突变株(△ath1)、中性海藻糖酶缺失突变株(△nth1)和双缺失突变株(△ath1△nth1),并进行了耐性分析.[结果]结合PCR和Southernblot的结果,验证了突变株构建的正确.所有突变株的海藻糖积累量和细胞密度均高于亲本,冷冻、高温、高糖和酒精耐性提高了.[结论]说明海藻糖含量与酵母耐性有一定的相关性.突变株耐性的改善,表明它们在酿造和烘焙产业中具有潜在的商业价值.     

季节性流感病毒 H1N1 BALB / c 鼠肺适应株的建立及其分子机制简

目的 建立季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株,并对适应的分子机理进行研究.方法 以病毒滴鼻感染小鼠,通过在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,观察小鼠存活情况及肺病理改变,来获得季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株.结果季节性流感H1N1 A/Brisbane/59/2007病毒野生型毒株,经过在小鼠体内进行8次传代后,毒力逐渐增强,从无致病力到致死率达到100%,对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对,发现适应株HA基因发生了3个有义突变.结论 野生季节性低致病力H1N1流感病毒可经在小鼠中经过多次传代而获得高致病力H1N1鼠肺适应株,HA蛋白89位Thr至Ile的突变对毒力的增强起决定性作用.     

两种裸藻的无叶绿体突变株

利用Ofloxacin处理获得了纤细裸藻和中型裸藻无叶绿体突变株。吸收光谱测定和自荧光显微观察证明突变株无叶绿素合成,DAPI染色方法显示突变株细胞不存在质体DNA,而无色的长变胞藻细胞中仍有可检测质体DNA,说明二突变株质体已消失。SDS－PAGE显示野生种和突变株各有特异蛋白表达。