Pip介导铜绿假单胞菌吩嗪基因簇phz2的表达

[目的]为了确定铜绿假单胞菌调控因子Pip对两个不同吩嗪合成基因簇(phz1和phz2)的具体调控方式与可能的调控机制.[方法]根据基因比对结果,采用同源重组技术构建Pip调控因子缺失突变株PA-PG以及克隆ip基因作互补分析;再以已构建的吩嗪基因簇缺失突变株PA-Z1G和PA-Z2K为受体菌,构建突变株PA-PD-Z1G和PA-PG-Z2K,测定并比较野生株及相关突变株的吩嗪-1-羧酸和绿脓菌素的合成量,推定Pip对两个不同吩嗪合成基因簇的调控方式.[结果]在GA培养基中,突变株PA-PG的吩嗪-1-羧酸和绿脓菌素都比野生型明显减少;互补分析显示,突变株PA-PG的吩嗪-1-羧酸和绿脓菌素都显著提高并恢复到野生株PAO1水平;突变株PA-Z1G的吩嗪-1-羧酸和绿脓菌素合成量因Pip缺失而显著减少;而突变株PA-Z2K的吩嗪-1-羧酸和绿脓菌素合成量在Pip缺失后仍保持不变.[结论]初步推定,转录调控因子Pip对铜绿假单胞菌吩嗪合成代谢的确具有促进作用;Pip通过正向调控吩嗪基因簇phz2的合成功能实现对吩嗪合成代谢的调控.     

铜绿假单胞菌全局调控因子RsmA的缺失影响2个吩嗪基因簇的表达

[目的]为了研究铜绿假单胞菌全局调控因子RsmA对两个吩嗪(Phenazine)合成基因簇phz1和phz2的调控方式与机制.[方法]采用基因缺失和抗性基因(gentamycin resistance cassette,aacC1)插入相结合的策略构建了rsmA基因缺失突变株PA-RG ;通过构建互补表达载体和过表达载体,进一步确认RsmA对绿脓菌素的调控作用 ;采用电转化方法将构建的翻译融合表达载体pMEZ1(phz1'-'lacZ)和pMEZ2(phz2'-'lacZ)分别导入铜绿假单胞菌突变株PA-RG和野生株PAO1,采用Miller法测定融合β-半乳糖苷酶活性.[结果]在GA培养基中,互补分析和过表达分析表明,RsmA抑制绿脓菌素的合成.此外,pMEZ1在突变株PA-RG中的表达增强,为野生株的2-3倍 ;而pMEZ2在突变株PA-RG中的表达降低,野生株是突变株的2倍.[结论]由此初步判定,铜绿假单胞菌全局调控因子RsmA对两个不同吩嗪合成基因簇的调控作用具有特异性,在一定程度上RsmA负调控phz1,正调控phz2.     

rpoS基因插入突变对铜绿假单胞菌两个吩嗪合成基因簇的调控

【目的】为了研究铜绿假单胞菌rpoS基因对吩嗪(Phenazine)合成基因簇phz1和phz2的调控方式与机制。【方法】采用抗庆大霉素基因(gentamycin resistance cassette,aacC1)插入失活的策略构建了rpoS基因突变株PA-SG;同时利用lacZ的翻译融合表达载体pME6015,构建了phz1′-′lacZ和phz2′-′lacZ翻译融合表达载体pMEZ1和pMEZ2。采用电转化法分别将pMEZ1、pMEZ2和pME6015导入铜绿假单胞菌突变株PA-SG和野生株PAO1,用Miller法检测融合β-半乳糖苷酶活性。【结果】在KMB或PPM培养基中,pMEZ1在突变株PA-SG中的表达均增强,为野生株的4-5倍;而pMEZ2在突变株PA-SG中的表达均降低,野生株是突变株的2-3倍。【结论】由此推测,铜绿假单胞菌rpoS基因对两个不同吩嗪合成基因簇的调控作用具有特异性,在一定程度上,rpoS负调控phz1,正调控phz2。     

rpoS基因缺失突变对荧光假单胞菌胁迫耐受性、群体感应及腐败活性的影响

【目的】微生物活动是引起食品腐败的主要原因,研究食品腐败菌的腐败作用调控机制对于保证食品的质量和安全具有重要意义。荧光假单胞菌是一种代表性的食品腐败菌,本文旨在研究RNA聚合酶的选择性sigma因子Rpo S在荧光假单胞菌致腐败过程中的作用。【方法】运用同源重组的方法构建荧光假单胞菌冷藏鱼分离株的rpo S基因缺失突变株,比较野生型和突变株暴露于不同胁迫条件下的存活率;通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析野生型和突变株产生高丝氨酸内酯类(AHLs)群体感应信号分子的种类和含量;检测野生型和突变株接种于灭菌三文鱼汁后4°C贮存过程中的菌落总数和挥发性盐基氮的生成量。【结果】成功构建了荧光假单胞菌rpo S基因缺失突变株。rpo S基因的缺失导致荧光假单胞菌对10 mmol/L H2O2和15%乙醇的耐受性显著降低,对150μg/m L结晶紫和175 mmol/L醋酸的耐受性有一定程度增强,不影响其对47°C和20%Na Cl的耐受性。荧光假单胞菌在rpo S基因缺失突变后长链信号分子C_(10)-HSL、C_(12)-HSL和C_(14)-HSL的含量增加。在灭菌三文鱼汁中的腐败活性检测表明rpo S基因缺失可导致荧光假单胞菌挥发性盐基氮的生成量显著降低。【结论】荧光假单胞菌的Rpo S不仅调节细菌对多种胁迫条件的耐受性,还影响AHL群体感应和腐败活性。     

MvaT调控铜绿假单胞菌吩嗪的合成机制

【背景】属于H-NS家族的MvaT转录因子参与了铜绿假单胞菌的许多重要代谢过程,如吩嗪合成代谢,但其调控方式仍不十分明确。【目的】确定转录调控因子MvaT是否直接调控铜绿假单胞菌的吩嗪合成过程,即该蛋白是否可以直接结合2个吩嗪-1-羧酸合成基因簇(phzA1G1和phzA2G2)与3个分支转化基因(phzH、phzS和phzM)的上游启动子区域。【方法】以铜绿假单胞菌SJTD-1和其mvaT基因敲除突变株SJTD-1(ΔmvaT)为研究对象,检测其在不同培养基条件下吩嗪化合物的合成量差异。通过体外异源表达与亲和纯化,获得重组蛋白MvaT。利用凝胶阻滞实验,确定MvaT重组蛋白对5个吩嗪代谢基因簇/基因上游启动子的结合情况。【结果】mvaT基因敲除突变株SJTD-1(ΔmvaT)的吩嗪产量较野生型显著提升。MvaT重组蛋白被有效表达与纯化,体外凝胶阻滞实验结果显示,该重组蛋白可与phzA1G1、phzA2G2、phzM、phzS和phzH的上游启动子区域均发生特异性结合。其中,重组蛋白MvaT与phzA1G1和phzA2G2的结合区域位于其上游启动子的200 bp以内,而该蛋白与phzM、phzS和phzH的结合区域则位于其上游启动子的100 bp以内。【结论】MvaT蛋白通过直接结合吩嗪合成代谢基因的上游启动子区域来直接调控假单胞菌的吩嗪类化合物合成。     

藤黄绿脓菌素的自诱导及假单胞菌M18抗生物质代谢相关性初步分析

假单胞菌M18的生防功能归功于其分泌吩嗪-1-羧酸和藤黄绿脓菌素。为了研究抗生物质合成代谢相关性及调控机制,分别构建了两种抗生物质合成基因簇插入突变株M18T和M18Z1。用翻译融合表达载体pMEAZ(pltA′-′lacZ)分别转化野生株和突变株M18T、发酵培养并测定β-半乳糖苷酶活性,结果显示,添加藤黄绿脓菌素使突变株M18T(pMEAZ)的β-半乳糖苷酶活性比野生株M18(pMEAZ)增加约6倍,表明藤黄绿脓菌素对自身基因簇具正向自诱导作用。抗生物质的测定结果显示,突变株M18T无藤黄绿脓菌素合成,而吩嗪-1-羧酸的合成量与野生株相同;突变株M18Z1与野生株相比,吩嗪-1-羧酸明显减少,藤黄绿脓菌素却显著提高。过量的吩嗪-1-羧酸又抑制藤黄绿脓菌素的合成。表明,假单胞菌M18中独有的代谢相关方式为:藤黄绿脓菌素不影响吩嗪-1-羧酸,但吩嗪-1-羧酸负调控藤黄绿脓菌素。     

RNA聚合酶σ^38亚基缺失对假单胞菌抗生物质合成代谢的影响

设计引物从假单胞菌M18基因组DNA中扩增并获得rpoS基因的378bp保守区段。以此为探针,从假单胞菌基因组文库中克隆了包括rpoS基因全序列及其相邻序列的3·1kbEcoRⅠ-XhoⅠ片段。通过抗性基因(抗庆大霉素基因)的定点插入构建了σ38亚基缺失突变株M18S。HPLC检测结果显示,σ38亚基缺失引起该菌株的抗生物质合成代谢的显著变化。与野生株相比,缺失突变株的吩嗪-1-羧酸在PPM和KMB中2种培养基中合成量由58μg/mL和10·2μg/mL分别减少到20·4μg/mL和0μg/mL;而缺失突变株的藤黄绿脓菌素则相反,在PPM和KMB两种培养基中合成量由0·5μg/mL和20·5μg/mL分别提高到75·4μg/mL和185·6μg/mL。表明σ38亚基可区别性调控假单胞菌M18的抗生物质合成代谢。rpoS基因的互补实验和两种抗生素基因与β-半乳糖苷酶基因的翻译融合表达实验进一步验证了上述的结果:σ38亚基正调控吩嗪-1-羧酸的表达,而负调控藤黄绿脓菌素的表达。     

RNA聚合酶σ38亚基缺失对假单胞菌抗生物质合成代谢的影响

设计引物从假单胞菌M18基因组DNA中扩增并获得rpoS基因的378bp保守区段。以此为探针,从假单胞菌基因组文库中克隆了包括rpoS基因全序列及其相邻序列的3.1kb EcoRⅠ_XhoⅠ片段。通过抗性基因（抗庆大霉素基因）的定点插入构建了σ38亚基缺失突变株M18S。HPLC检测结果显示,σ38亚基缺失引起该菌株的抗生物质合成代谢的显著变化。与野生株相比,缺失突变株的吩嗪_1_羧酸在PPM和KMB中2种培养基中合成量由58μg/mL和10.2μg/mL分别减少到20.4μg/mL和0μg/mL;而缺失突变株的藤黄绿脓菌素则相反,在PPM和KMB两种培养基中合成量由0.5μg/mL和20.5μg/mL分别提高到75.4μg/mL和185.6μg/mL。表明σ38亚基可区别性调控假单胞菌M18的抗生物质合成代谢。rpoS基因的互补实验和两种抗生素基因与β_半乳糖苷酶基因的翻译融合表达实验进一步验证了上述的结果: σ38亚基正调控吩嗪_1_羧酸的表达,而负调控藤黄绿脓菌素的表达。     

GacA对假单胞菌株M18两个phz基因簇和菌群传感的调控

摘要:【目的】假单胞菌株M18（Pseudomonas sp. M18）是从甜瓜根际土壤中分离获得的一株对多种植物病原菌具有显著拮抗作用的菌株,在菌群传感（quorum sensing）系统的调控下,能分泌吩嗪-1-羧酸（PCA）以及多种吩嗪（phz）类衍生物的抗真菌物质。全局性因子GacA是M18菌株吩嗪类物质的合成与菌群传感系统的重要调控因子,本文将就GacA对上述两者的调控做进一步研究。【方法】PCR基因扩增和测序研究M18菌株中PCA合成基因簇,运用RT-PCR及构建phzA-lacZ转录融合手段     

铜绿假单胞菌M18 rsmY突变株的构建及其对PCA和Plt的区别性调控

【目的】在假单胞菌中,小RNA(sRNA)参与初级和次级代谢产物、多种毒素因子以及菌群传感系统的调控,通过在植物根际促生铜绿假单胞菌M18中研究RsmY对吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素(Plt)两种抗生素的调控作用,深入了解假单胞菌中次级代谢的途径并为构建高产抗生素工程菌株提供了一定的理论基础。【方法】运用同源重组技术,构建了铜绿假单胞菌M18株的rsmY突变菌株M18RY,通过基因过表达、lacZ报告基因融合分析实验,进一步验证了RsmY对抗生素合成基因的调控作用。【结果】比较野生型M18和突变株M18RY中PCA和Plt在同一培养条件下的生物合成量,突变菌株M18RY中PCA的产量显著增加,为野生型菌株的5倍左右,而Plt的产量降为野生型的1/8。LacZ报告基因融合分析进一步证明了RsmY对PCA的负调控作用主要是通过phz2基因簇来实现的。【结论】结果表明,rsmY基因区别性调控PCA和Plt的生物合成。     

Mn~(2+)对肠膜状明串珠菌产右旋糖酐的影响

肠膜状明串珠菌在其产生的右旋糖酐蔗糖酶的作用下,以蔗糖为原料转化合成右旋糖酐和产生果糖。着重进行了Mn~(2+)对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐影响的初步探索。对Mn~(2+)对肠膜状明串珠菌Lm-1226的生长,产果糖、右旋糖酐和右旋糖酐蔗糖酶,右旋糖酐蔗糖酶作用影响进行了研究。一定浓度的Mn~(2+)对肠膜状明串珠菌Lm-1226的生长具有促进作用; Mn~(2+)抑制肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产果糖和右旋糖酐,且Mn~(2+)浓度越高,抑制性越强; Mn~(2+)对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐蔗糖酶有抑制作用; Mn~(2+)对右旋糖酐蔗糖酶具有较强的激活作用,激活作用可达158%,最适Mn~(2+)浓度为5. 0 mmol/L。     

Fluorescent labeling of (Na + K)-ATPase by 5-iodoacetamidofluorescein

5-Iodoacetamidofluorescein (5-IAF) covalently labels dog kidney (Na⁺ + K⁺)-ATPase with approximately 2 moles incorporated per mole of enzyme. ATPase and K⁺-phosphatase activities are fully retained after reaction, and the kinetic parameters for Na⁺, K⁺, Mg²⁺, ATP and p-nitrophenyl phosphate are likewise not significantly affected. The fluorescence of the bound 5-IAF is increased by ATP, Na⁺, and Mg²⁺, and decreased by K⁺. These fluorescence changes likely reflect ligand-induced stabilization of the E₁ or E₂ states of the enzyme.     

Annular and non-annular binding sites on the (Ca + Mg)-ATPase

Quenching of the fluorescence of the (Ca²⁺ + Mg²⁺)-ATPase purified from muscle sarcoplasmic reticulum can be used to measure relative binding constants of hydrophobic compounds to the phospholipid-protein interface. We show that the binding constant for cholesterol is considerably less than that for phosphatidylcholine, so that cholesterol is effectively excluded from the phospholipid annulus around the ATPase. However, dibromocholestan-3β-ol causes quenching of the fluorescence of the ATPase, and so has access to other, non-annular sites. We suggest that these non-annular sites could be at protein/protein interfaces in ATPase oligomers. Oleic acid can bind at the phospholipid/protein interface, although its binding constant is less than that for a phosphatidylcholine, and it can also bind at the postulated non-annular sites. The effects of these compounds on the activity of the ATPase depend on the structure of the phospholipid present in the systems.     

(Na + K)-ATPase activity of crude homogenates of rat skeletal muscle as estimated from their K-dependent 3-O-methylfluorescein phosphatase activity

A highly sensitive fluorimetric assay using 3-O-methylfluorescein phosphate as substrate was used in the determination of K⁺-dependent phosphatase activity in preparations of rat skeletal muscle. The gastrocnemius muscle was chosen because of mixed fibre composition. Crude, detergent treated homogenate was used so as to avoid loss of activity during purification. K⁺-dependent phosphatase activities in the range 0.19–0.37 μmol · (g wet weight)⁻¹ · min⁻¹ were obtained, the value decreasing with age and K⁺-deficiency. Complete inhibition of the K⁺-dependent phosphatase was obtained with 10⁻³ M ouabain. Using a KSCN-extracted muscle enzyme the intimate relation between K⁺-dependent phosphatase activity and (Na⁺ + K⁺)-activated ATP hydrolysis could be demonstrated. A molecular activity of 620 min⁻¹ was estimated from simultaneous determination of K⁺-dependent phosphatase activity and [³H]ouabain binding capacity using the partially purified enzyme preparation. The corresponding enzyme concentration in the crude homogenates was calculated and corresponded well with the number of [³H]ouabain binding sites measured in intact muscles or biopsies hereof.     

The phospholipid requirement of the (Ca + Mg)-ATPase from human platelets

The phospholipid requirement of the (Ca²⁺ + Mg²⁺)-ATPase present in a membrane fraction from human platelets was studied using various purified phospholipases. Only those phospholipases, which hydrolyse the negatively charged phospholipids, inhibited the (Ca²⁺ + Mg²⁺)-ATPase activity. The ATPase activity could be restored by adding mixed micelles of Triton X-100 and phosphatidylserine or phosphatidylinositol. Micelles with phosphatidic acid, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine or sphingomyelin could not be used for reconstitution and inhibited the activity of the native enzyme.     

镉胁迫下硒对罗汉果组培苗光合特性的影响

实验以罗汉果组培苗为材料,室内栽培在内装市售营养土的塑料盆中,以0、10、50、100、200mg·kg-1浓度镉离子和1mg·kg-1浓度硒处理,培养20d后分析罗汉果幼苗的相关光合生理指标。结果表明:低浓度Cd2+对叶片叶绿素含量、光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)影响不大或稍有上升,但高浓度镉离子处理植株叶片的叶绿素含量、光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)明显下降;随Cd2+处理浓度的增加,叶片胞间CO2浓度(Ci)呈现上升趋势;加硒则延缓叶绿素下降,促进光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)上升,降低叶片胞间CO2浓度(Ci)。表明高浓度镉离子的毒害导致罗汉果组培苗叶片光合性能受到伤害,从而影响罗汉果幼苗生长。镉硒混合处理反映出硒对镉的毒害有缓解作用。     

应用15N示踪研究欧美杨对PM2.5无机成分NH4+和NO3-的吸收与分配

通过气溶胶发生系统模拟PM2.5颗粒的发生,运用15N示踪技术研究了欧美杨107(Populus euramericana Neva.)对PM2.5中水溶性无机成分NH+4和NO-3的吸收与分配规律。结果表明,欧美杨能够有效吸收PM2.5中的NH+4和NO-3。轻度和重度污染下,欧美杨叶片对NH+4和NO-3的吸收速率均于处理后第1天达到峰值,之后,轻度污染下对NH+4和NO-3的吸收速率迅速降低以后趋于稳定,而重度污染下对NH+4和NO-3的吸收速率缓慢下降至趋于稳定。轻度污染下的欧美杨叶片的15N含量在处理后第1天达到峰值,15N(NH+4)的含量为0.11 mg/g,干重,15N(NO-3)的为0.14 mg/g,干重,之后15N含量迅速下降至趋于稳定。重度污染下的叶片15N含量在处理第1天迅速增长,之后缓慢增长至处理后第7天达到最高值,15N(NH+4)的含量为0.11 mg/g,干重,15N(NO-3)的为0.13 mg/g,干重。处理7 d后,欧美杨不同组织器官吸收或通过再分配获取的15N含量存在差异。轻度污染下,细根对NH+4和NO-3的吸收量最高,树皮、叶柄、叶片次之,髓最低。而重度污染下,叶片对NH+4和NO-3的吸收量最高,细根、叶柄、树皮次之,髓最低。欧美杨各组织器官中NH+4和NO-3的含量均表现为重度污染大于轻度污染,且两种污染程度下的欧美杨各组织器官对NO-3的吸收均大于对NH+4的吸收。重度污染下,欧美杨茎木质部对15N(NH+4和NO-3)的吸收征调能力(Ndff,Nitrogen derived from fertilizer)最大,其次为髓,叶片最小;欧美杨各组织器官中的15N分配率表现为叶片细根叶柄树皮粗根茎木质部髓。研究结果对进一步揭示植物吸收PM2.5的机制及有效利用植物降低颗粒物污染、净化环境提供了重要的科学理论依据。     

Isolation, cloning and expression analysis of EcPMA1, a putative plasma membrane H-ATPase transporter gene from the biotrophic pathogenic fungus Erysiphe cichoracearum

Little is known at the molecular level about the transporters involved in nutrient transfer in the plant/powdery mildew interaction. A PCR-based approach was used to identify and isolate a partial-length cDNA coding for an isoform of the plasma membrane H⁺-ATPase (EcPMA1) in the biotrophic pathogenic fungus Erysiphe cichoracearum. Southern analysis suggests that EcPMA1 exists as a single-copy gene. Sequence analysis indicated a high similarity of EcPMA1 to other fungal H⁺-ATPases. Expression of EcPMA1 increases in infected Arabidopsis leaves as the disease progresses, correlating with the growth of the pathogen.     

Cr3+和Cd2+对普通小球藻生长及抗氧化酶活性的影响

[目的] 为探究重金属对淡水绿藻生长的影响。[方法] 选取对水质检测具有明显指示作用的普通小球藻（Chlorella vulgaris）为实验材料,CdCl₂·2H₂O和CrCl₃·7H₂O提供重金属离子,探究不同浓度Cr³⁺和Cd²⁺在单一和复合胁迫下对藻细胞浓度、叶绿素a及相关抗氧化酶活性的影响。[结果] 随着Cr³⁺和Cd²⁺浓度不断增加,藻细胞浓度呈先增长后下降趋势;叶绿素a含量呈现先下降后升高再下降的现象,浓度为1 mg/L的单一和复合胁迫下有最大值,且毒性作用表现为Cr³⁺ < Cd²⁺ < Cr³⁺+Cd²⁺;与藻细胞膜相关的丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量随着重金属离子浓度的增大而增长;重金属离子浓度低于10 mg/L时对藻细胞内抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）表现为促进作用,而大于10 mg/L时具有抑制作用。[结论] 结果表明在单一或复合重金属胁迫下,普通小球藻会充分调动与抗逆性相关的酶来维持自身的正常生长。     

重金属Cr6+胁迫对茳芏生理生态特征的影响

采用盆栽模拟试验,研究了不同水平重金属Cr6+对茳芏生理生态的影响,探索了茳芏对重金属的抗性机理,充实有关盐沼植物的污染生态学研究。结果表明:(1)Cr6+胁迫对茳芏生物量具抑制作用;(2)叶绿素含量及叶绿素a/b比值显著降低,并对净光合速率(Pn)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)及气孔导度(Gs)产生显著负面影响;(3)各浓度Cr6+胁迫对茳芏根系活力表现为抑制效应;(4)在Cr6+胁迫下,茳芏过氧化氢酶(CAT)活性均比对照低(除50mg/L外),超氧化歧化酶(SOD)活性随Cr6+浓度增加呈降低趋势,而过氧化物酶(POD)活性则持续上升。丙二醛(MDA)、细胞膜透性和脯氨酸(Pro)随Cr6+浓度增加显著增加,表明Cr6+胁迫对茳芏细胞质膜系统及主要细胞器的结构与功能都具有较强的破坏作用。