青藏高原黄绿蜜环菌纯培养菌种的分离培养及分子鉴定

首次从采自青藏高原、与高原牧草嵩草属Kobresia草本植物形成外生菌根的黄绿蜜环菌Armillarialuteo-virens子实体中分离获得一组织分离菌株,运用rDNA-ITS和rDNA-IGS-1测序技术对该组织分离菌株是否为黄绿蜜环菌的纯培养菌种进行分子鉴定,并基于黄绿蜜环菌的5.8S/ITS和IGS-1序列进行核酸序列数据库GenBank同源性检索比对、构建系统发育树。结果表明,本研究获得的黄绿蜜环菌子实体组织分离菌株即为其纯培养菌种。基于ITS的系统发育分析表明黄绿蜜环菌与口蘑科内其它属间物种的系统发育关系较远;基于IGS-1的系统发育分析表明黄绿蜜环菌与蜜环菌属内的其它种序列差异较大,系统发育关系较远,而与Lepiota属内的部分种具有较近的系统发育关系。本研究首次基于分子手段对我国青藏高原的黄绿蜜环菌种进行了分离培养、分子鉴定和系统发育分析,为黄绿蜜环菌的科学分类提供了分子依据。     

番茄灰霉病生防链霉菌筛选及鉴定

【背景】由灰葡萄孢侵染所致的番茄灰霉病是一类重要的真菌病害,生物防治具有环境友好、病原菌不易产生抗药性等特点,是果蔬灰霉病绿色防控的有效措施。【目的】筛选对番茄灰霉病具有防病作用且能促进番茄种子发芽的广谱拮抗性链霉菌,并明确该菌株种级分类地位。【方法】采用琼脂块法筛选拮抗番茄灰霉病菌的链霉菌菌株,采用对峙培养法和生长速率法检测菌株T22抑菌谱,通过产胞外酶活性检测、离体叶片防效和种子发芽试验明确该菌株的防病促生相关特性,根据形态学特征、生理生化特性和分子生物学方法对该菌株进行种类鉴定。【结果】从分离的56株放线菌中筛选到14株对番茄灰霉病菌具有拮抗效果的放线菌菌株,其中链霉菌T22对番茄灰霉病菌抑制作用最强,且具有较广抑菌谱,同时菌株T22具有产生纤维素酶和几丁质酶的能力。菌株T22无菌发酵滤液对番茄灰霉病菌、桃褐腐病菌、黄瓜枯萎病菌抑菌率分别为84.6%、81.5%和79.1%;其无菌发酵滤液原液对番茄灰霉病离体防效为55.1%;100倍稀释液处理番茄种子,胚轴、胚根和种子活力指数分别增加15.1%、29.7%和43.9%。根据形态学特征、生理生化特性和多基因聚类分析将链霉菌T22鉴定为白黑链霉菌(Streptomycesalboniger)。【结论】白黑链霉菌T22具有较强的抗真菌、产胞外酶、防病和促生活性,在番茄灰霉病生物防治中具有较好的开发应用潜力。     

番茄灰霉菌拮抗放线菌LA-5的筛选及鉴定

利用稀释涂布法从番茄根际土壤中分离放线菌,并以番茄灰霉菌为靶标,利用对峙培养法和牛津杯法筛选拮抗放线菌,得到一株具有较强抑菌活性的放线菌LA-5.通过培养特征、生理生化特性及基于16S rDNA 序列系统进化分析,将菌株LA-5初步鉴定为链霉菌.复筛结果显示,LA-5发酵滤液对番茄灰霉菌孢子萌发及菌丝生长均有明显的抑制作用,其中100倍发酵滤液对孢子萌发抑制率和菌丝生长抑制率均在50%以上;受抑制菌落呈白色,气生菌丝萎缩稀疏,菌丝纤细、分支明显减少.离体防效试验显示,菌株LA-5发酵原液对番茄灰霉病防效可达83.4%.该菌株有望开发为防治番茄灰霉病的生防菌株.     

番茄灰霉病害及其微生物防治的研究进展

综述了番茄灰霉病的病害,并从国内外拮抗菌以及内生菌的筛选和利用等方面概述了番茄灰霉病微生物防治的研究进展,提出了目前番茄灰霉病微生物防治的问题及今后的应用前景。     

浙江番茄灰叶斑病病原菌

近年浙江省杭州市余杭区温室大棚内番茄灰叶斑病发生为害严重,对当地番茄生产造成了较大的经济损失,但该病害的病原菌种类尚未在浙江报道。本文通过对病原菌形态学、分子系统学（rDNA-ITS、gpd和EF-1α基因的PCR扩增、序列分析和系统进化树的构建）和致病性测定相结合的研究,将侵染番茄的病原菌鉴定为番茄匍柄霉菌Stemphylium lycopersici。研究结果对制定该病害的防治决策和有效防治提供了科学理论依据。     

1株拮抗真菌的生防细菌Xj11的分离与鉴定

从江西省井冈山自然保护区发病毛竹中分离到1株具有明显抑制植物病原真菌活性的生防细菌Xj11。其对小麦赤霉病菌、尖孢镰刀菌、甘蔗节菱孢菌、链格孢菌和炭角菌均有较强的抑制作用。通过形态特征和培养特征观察、生理生化实验及16S rDNA序列系统发育分析,初步鉴定该菌为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌,命名为Burkholderia gladioli strain Xj11。     

1株生防细菌的筛选、鉴定及其抑菌特性的初步研究

从鲜牛奶中筛选1株对番茄灰霉病菌具有拮抗作用的菌株A9,经16S rDNA序列分析,鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。抑菌特性研究表明,该菌株代谢产物会造成番茄灰霉病菌菌丝畸形,同时抑制其孢子生长,使孢子细胞壁破裂;代谢粗提物经过DEAE-52离子交换层析及Sephadex-G50凝胶柱层析后,电泳检测到具有抑菌活性且分子量约为17ku的单一条带,经验证该抑菌物具有蛋白酶活性。     

基于香菇菌株rDNA-ITS序列的系统发育分析

根据真菌核糖体通用引物ITS1和ITS4扩增出13个福建袋栽香菇主要菌株的5.8S rDNA、ITS序列,对该序列进行测序后,得到完整的5.8S rDNA、ITS序列,将该序列提交NCBI并获得登录号,对该序列进行比对分析并构建了系统发育树,从分子水平对香菇菌株进行了区分鉴定,结果显示13个菌株可以明显的分成2丛,而其他菌株又可以从一丛中延伸出几个亚丛。     

海洋喇叭虫rRNA基因18S-ITS1序列及其系统发育分析

海洋喇叭虫Maristentor dinoferus 1996年在关岛(Guam)的珊瑚暗礁上被发现,至今尚未阐明其确切的系统发育地位.克隆到的海洋喇叭虫的18S-ITS1-5.8S rDNA序列包括222 bp的18S序列,77 bp的ITS1序列和22 bp的5.8S序列.比较分析了纤毛虫主要类群的ITS1序列后得出:短的ITS1序列可能是异毛类纤毛虫的特征.根据18S序列,利用邻接法构建,最大简约法和最大似然法构建系统发育树.其拓扑结构显示海洋喇叭虫属于异毛纲纤毛虫,但并不隶属喇叭虫科,应予以新的分类地位.     

基于rDNAITS序列分析Alternaria与相似属的关系及A.leucanthemi的分类地位

对Alternaria,Stemphylium,Ulocladium,Nimbya,Embellisia等五个形态相似属的代表性种进行了5.8S/ITS区段序列测定,连同从GenBank下载的相关有性型Pleospora,Lewia的同项资料,由Neighbor-joining方法构建系统发育树。序列对比结果显示,所有参试的菌株/种的5.8SrDNA序列保守程度较高,ITS序列变化较大,ITS1比ITS2变化更大。由5.8S/ITS构建的系统发育树可以足够将供试菌区分到属;系统发育树显示Alternaria,Ulocladium,Nimbya和Embellisia系统学关系较近,又存在一定的分化;Stemphylium聚在相对较远的分支上,与上述四属关系较远,相对独立进化;有性型的Pleospora与无性型的Stemphylium被聚到一个分支,这种不同阶段菌株在遗传基础上的一致,充分证明所用方法及所选测序的rDNA区段对本类群真菌的分类很有价值。Alternarialeucanthemi位于系统发育树的外侧,较为独立进化,与Alternaria的其它种亲缘关系较远,却与Stemphyliumspp.和Bipolarisspp.关系较近,对其目前的分类地位提出质疑。     

生防细菌CNY-04筛选、鉴定及其对灰霉病菌的防效

【目的】为研究土壤细菌对蔬菜灰霉病的生防价值, 从辽宁、山东等地区的蔬菜种植基地采集土壤样本56份, 分离、筛选出对灰霉病具有稳定拮抗作用的细菌9株。【方法】采用平板对峙培养法进行初筛、复筛, 用抑菌圈法测定其抑菌效果, 并进行离体果实试验验证其对蔬菜灰霉病的防治效果, 通过形态学特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析研究其分类地位。【结果】细菌CNY-04对蔬菜灰霉病的拮抗能力最强且遗传稳定, 抑菌圈直径达到34 mm; 初步鉴定该菌株为格氏沙雷菌(Serratia grimesii), 尚未见该菌在生防上的报道; CNY-04液体菌剂对离体番茄果实灰霉病的防效为69.23%, 50%多菌灵防效为75.39%, 24 h时接种CNY-04处理的番茄发病率为40.0%, 而48 h时接种处理的发病率为51.1%。【结论】CNY-04是一株较为理想的拮抗菌, 丰富了生防资源。     

猪场沼液对蔬菜病原菌的抑制作用

用不同贮存时间的猪场沼液对7种蔬菜病原菌的抑制作用进行了研究。结果表明,新鲜猪场沼液原液对番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、辣椒疫病菌、黄瓜炭疽病菌和茄子灰霉病菌有较强的抑制作用,沼液贮存对番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌和茄子灰霉病菌的抑制效果没有显著影响,但对辣椒疫病菌和黄瓜炭疽病菌的抑制效果影响显著;新鲜猪场沼液滤液对番茄灰霉病菌和茄子灰霉病菌有较强的抑制作用,沼液滤液贮存对番茄灰霉病菌和茄子灰霉病菌的抑菌效果没有显著影响。     

生防工程菌株BS-17A稳定性与抑菌活性初步研究

目的:BS-17是内生细菌,对番茄灰霉病菌、叶霉病菌和枯萎病菌具有显著抑菌活性,为了跟踪研究野生型菌株BS-17在番茄根围和叶围的定殖情况,构建了1株带有黄绿荧光蛋白基因标记的生防菌株BS-17A.方法:采用NYD连续培养的方法和平皿抑菌试验的方法对工程菌株的遗传稳定性和抑菌活性进行了初步研究.结果:该工程菌在无选择压力培养基中连续培养50h,质粒遗传稳定性为94%,对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、叶霉病菌Cladosporiumfulvum和枯萎病菌Fusarium oxysporum的抑制作用与野生菌无显著差异,平皿抑菌率分别为85.5%、86.5%和89.8%.结论:该工程菌具有较强的遗传稳定性和抑菌活性.     

基于rDNAITS序列分析Alternaria与相似属的关系及A.leucanthemi的分类地位

对Alternaria,Stemphylium,Ulocladium,Nimbya,Embellisia等五个形态相似属的代表性种进行了5.8S/ITS区段序列测定,连同从GenBank下载的相关有性型Pleospora,Lewia的同项资料,由Neighbor-joining方法构建系统发育树。序列对比结果显示,所有参试的菌株/种的5.8SrDNA序列保守程度较高,ITS序列变化较大,ITS1比ITS2变化更大。由5.8S/ITS构建的系统发育树可以足够将供试菌区分到属;系统发育树显示Alternaria,Ulocladium,Nimbya和Embellisia系统学关系较近,又存在一定的分化;Stemphylium聚在相对较远的分支上,与上述四属关系较远,相对独立进化;有性型的Pleospora与无性型的Stemphylium被聚到一个分支,这种不同阶段菌株在遗传基础上的一致,充分证明所用方法及所选测序的rDNA区段对本类群真菌的分类很有价值。Alternarialeucanthemi位于系统发育树的外侧,较为独立进化,与Alternaria的其它种亲缘关系较远,却与Stemphyliumspp.和Bip…     

三株具生防功能芽孢杆菌的分离鉴定及其生物活性研究

基于健康烟草根际土壤,分离筛选具功能多样化、活性高的菌株,为作物病害生物防治提供高效、多样化的生防资源。采用平板对峙法筛选活性高、抑菌谱广的菌株,测定菌株对番茄枯萎病病菌的抑制率、对菌丝生长及和孢子萌发率的影响;应用PCR技术,检测菌株抗生素合成基因,结合室内盆栽实验检测功能菌株对番茄枯萎病的防治效果,并测定其体外产酶、解磷、解钾、固氮及产铁载体能力;结合形态学、生理生化和16S rDNA通用引物对功能菌株进行鉴定;于健康烟草根际土壤分离得127个菌株,24株对番茄枯萎病病菌等指示病原菌具有抑制作用,活性较高的3个菌株SH-1471、SH-1464、SH-1439对番茄枯萎病菌抑制率分别为82.0%、74.0%、75.0%;可使番茄枯萎病菌菌丝扭曲变形,形成泡囊结构,对番茄枯萎病菌孢子萌发抑制率分别为62.7%、50.0%、37.0%;经测定,3个功能菌株具有产srfA、fenB、ituA、ituD、bymA等抗生素合成基因;盆栽实验结果表明SH-1471对番茄枯萎病的防效为83.7%,SH-1464对番茄枯萎病的防效为60.7%,SH-1439对番茄枯萎病的防效为59.0%;此外,3...     

水霉菌的形态及ITS区分子鉴定

研究利用形态学和分子生物学相结合的方法, 对从患病黄颡鱼病灶处分离的水霉菌株(HSY)的分类地位进行了研究。结果显示, 该菌在18—23℃均能形成游动孢子囊, 但只在20℃才大量释放游动孢子; 在15℃培养约3 周出现大量的藏卵器, 多数顶生, 形态与Saprolegnia litoralis 和Saprolegnia ferax 的均非常相似。序列比对分析显示, HSY 菌株与S. litoralis、S. bulbosa、S. oliviae、S. longicaulis、S. ferax、S. mixta 和S.anomalies 的ITS 区(包括5.8S rDNA)序列相似性均高于99%。系统发育分析显示, 所选的真菌分为3 个群,HSY 落于第一个群, MP 树显示HSY 菌株与S. litoralis、S. bulbosa、S. oliviae、S. longicaulis、S. ferax 以及S. mixta 枝系均互相平行, 而NJ 树显示其与S. ferax 和S. mixta 更近。综合形态学、ITS 区序列及系统发育分析, 将HSY 菌株暂定为多子水霉(Saprolegnia ferax)。       

云南芒果采后炭疽病病原菌的鉴定及室内生防菌的筛选

随着对云南芒果需求量的增加,其种植面积日趋扩大,并不断引入新品种,这也导致云南省芒果炭疽病害发生日趋加重。为了有针对性地开展芒果炭疽病的生物防治,采用组织块分离法分离芒果采后炭疽病病原菌,通过形态学观察初步鉴定,并遵循柯赫氏法则对病原菌进行验证。随后,利用rDNA-ITS序列和系统发育树分析明确病原菌的分类学地位。最后,采用5种生防细菌对病原菌进行拮抗试验。通过对芒果采后炭疽病病原菌进行分离鉴定,确定胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)是引起云南芒果采后炭疽病的病原菌,该菌株内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列长度为536 bp,登录号为MH744668;5株生防细菌对芒果炭疽病病原菌都有一定的抑菌作用,具有较好的生防开发潜能,其中抗生素溶杆菌L-44的抑菌效果最好,抑制率达53.7%。研究结果为云南省芒果采后病害的生物防治提供了新的思路。     

利迪链霉菌K2对灰霉病菌的抑菌效果及抑菌物质鉴定

灰霉病是多种经济作物生产过程以及果蔬储藏运输中常见的病害,链霉菌能产生丰富的次级代谢产物,对灰霉病菌具有较好的抑制效果。【目的】筛选出更高效、功能更多的链霉菌,为针对灰霉病的生防菌剂的研发提供优良菌种。【方法】采用管碟法对菌株K2进行液体培养基的筛选及培养液活性的测定;双皿对峙等2种方法进行产挥发性物质对灰霉病菌的抑菌活性测定;通过16S rRNA基因序列分析进行菌株K2鉴定;高效液相色谱及液相色谱-质谱2种方法对培养液活性成分进行定性验证;顶空固相微萃取-气质联用对菌株K2产生的挥发性物质成分进行检测及鉴定。【结果】菌株K2在液体培养基A中产生的次级代谢物对苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、核盘菌、杨树溃疡病菌和烟草赤星病菌等多种植物病原真菌均具有较强的抑制作用;K2产生的挥发性物质对灰霉病菌的抑制率达100%,且抑制效果与挥发性物质的量有关;菌株K2与利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)亲缘关系非常接近,相似性为99%;培养液活性成分中含有谷氏菌素、丰加霉素和纳他霉素;在挥发性物质成分中发现了烯类、醇类、酯类及烷烃类等30种挥发性物质,其中含量较多的物质分别是2-met...     

抑制西瓜蔓枯病菌的生防真菌筛选、鉴定及发酵条件优化

筛选对西瓜蔓枯病菌具有抑制作用的生防真菌,优化其发酵条件以提升发酵液抑菌效果。以平板对峙试验和摇瓶培养抑菌试验筛选拮抗真菌;根据形态学特征和18S rDNA序列分析进行菌株鉴定;通过扫描电镜观察对西瓜蔓枯病菌的寄生作用,以单因素试验和响应曲面法确定其最适发酵条件,在此基础上,通过盆栽试验研究其防病效果。结果表明:在所筛选到的9株生防真菌中M1菌株的抑菌率最高,其形态学特征与烟管菌(Bjerkandera adusta)相符,18S rDNA序列分析显示其与烟管菌在系统发育树上聚在一支,因此将菌株M1鉴定为黑管菌属(Bjerkandera)、烟管菌。在扫描电镜下观察到烟管菌能够直接穿透西瓜蔓枯病菌菌丝,对其发酵条件优化后确定了最佳条件组合:C/N为7.1,pH为7.4,装瓶量为44%,时间为19d,转速为180r/min,温度为29℃,在此条件下抑菌率为52.64%,高于未经优化的抑菌率。温室盆栽中对西瓜蔓枯病菌的防病效果达到74.3%,高于多菌灵处理。烟管菌作为生防真菌对西瓜蔓枯病菌具有较好的抑制作用,条件优化后进一步提升了抑菌效果,在生物防治中具有巨大应用潜力。     

一株番茄表面着生醋酸菌的分离鉴定及产酸条件优化

醋酸菌是食醋酿造过程中的关键菌种,性能优良的菌种对于产品品质的提升意义重大。以分离自番茄表面的产醋酸菌为研究对象,通过生理生化指标鉴定、16S rRNA编码基因比对及系统发育树构建等方法对其种类进行鉴定,并通过单因素实验、正交实验对鉴定为醋酸菌的菌株进行培养条件优化。结果表明,所分离的3株醋酸生产菌中,BQ-1被鉴定为醋酸杆菌属(Acetobacteraceae),在以酵母粉为主要氮源,蔗糖为主要碳源的培养基中,其最高产酸量为1823 g·L-1。由于该菌株在番茄表面具有很强的生长能力,因此有望应用于番茄果醋的酿造。