刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

利用RACE技术克隆刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)基因的全长cDNA序列,运用生物信息学方法对该基因进行分析,并通过RT-PCR法检测MDD在刺五加不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果表明:(1)刺五加MDD基因cDNA序列全长1 769bp(GenBank登录号为JQ905594),开放阅读框全长1 263bp,编码420个氨基酸残基,包含GHMP激酶超家族的特异性识别序列;刺五加MDD蛋白的二级结构中含有161个α螺旋,占38.33%;68个延伸链,占16.19%;19个β折叠,占4.52%;172个无规则卷曲,占40.95%;刺五加MDD蛋白无跨膜区域,定位于膜外。(2)刺五加MDD基因在不同生长发育时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。在整个生长期中,MDD的表达呈现高-低-高-低的变化趋势,第一个表达高峰出现在萌芽期至叶片完全展开时,第二个高峰出现在果实体积快速增长期,最高表达量(叶片完全展开期)为最低表达量(叶片衰老期)的4.51倍;不同器官中,幼茎的表达量最高,为最低表达量(叶片)的7.22倍,但叶片、叶柄和根中的表达量差异不显著。研究结果为阐明刺五加皂苷的生物合成及对其进行表达调控奠定了基础。     

刺五加鲨烯合酶基因cDNA的克隆与序列分析

采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参鲨烯合酶基因(squalene synthase gene,SS) cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SS基因的cDNA序列.克隆得到长度为1258 bp的刺五加SS基因cDNA序列,开放阅读框全长1248 bp,编码415个氨基酸残基,GenBank登录号为HQ456918,与人参的SS1、SS2和SS3氨基酸序列一致性分别为91.73％、97.59％和96.63％.首次分离并报道了刺五加SS基因cDNA序列,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机理研究提供参考.     

红树植物桐花树 E F1 A 基因的克隆与表达分析

通过 RACE 方法克隆到桐花树(Aegiceras corniculatum)的一个延伸因子基因, 命名为 AcEF1A(GenBank 登录号:KC416649)。该基因的 cDNA 全长 1 778 bp, CDS 为 1 350 bp, 编码 449 个氨基酸。多序列比对结果表明该氨基酸序列与琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)EF1A 的氨基酸序列高度相似(97.7%)。基因表达分析结果显示 AcEF1A 在茎尖中的表达量最高,叶片中的表达量次之, 根中的表达量最低。低温、高盐、干旱和重金属 Cd 胁迫下, 桐花树叶片中 AcEF1A 基因的表达水平有不同程度的上调。这些结果表明 AcEF1A 基因可能参与了植物的生长发育过程及逆境响应过程。     

丹参环阿屯醇合酶基因克隆及表达分析

以丹参cDNA为模板,克隆了丹参环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的cDNA序列(SmCAS),对其序列进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR方法研究了该基因在丹参不同器官及不同胁迫处理下的表达模式。结果显示:该基因全长2 346bp,包含2 271bp开放阅读框,编码756个氨基酸。预测其编码蛋白分子量为86.16kD,具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和QW结构域。该基因推测的氨基酸序列与人参、田七、积雪草、甘草、拟南芥的相似性分别为83%、84%、83%、81%和80%。SmCAS基因在丹参根、茎、叶、花中均有表达,在花中表达量最高;而且SmCAS基因能够响应ABA、低温和干旱的诱导。     

冠突曲霉AN1类锌指蛋白zfpA基因的克隆及表达分析

本研究采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆出冠突曲霉中zfpA基因的cDNA全长序列并进行生物信息分析。该序列全长1 443 bp,开放阅读框长度为924 bp,从312~1 235 bp,没有内含子序列。推测编码的蛋白质含有307个氨基酸,同源性分析显示该基因与米曲霉的AN1锌指蛋白(XP_001826567)相似性达71%。利用荧光定量PCR技术分析了zfpA基因在营养菌丝体阶段、无性产孢阶段及有性产孢阶段的表达量差异。结果表明,这个基因在在无性产孢时期的表达量最低,有性产孢时期的表达量最高,相比无性产孢时期上调了4倍。本实验为深入研究zfpA基因对冠突曲霉的产孢调控机制奠定了基础。     

大豆食心虫储存蛋白hexamerin基因的克隆与表达分析

【目的】储存蛋白是昆虫发育、变态和生殖过程中氨基酸的主要来源,Hexamerin是储存蛋白家族重要成员,在昆虫的生长发育中起着重要作用。为了研究hexamerin基因(SpbHex)在大豆食心虫Leguminivora glycinivorella Matsumurav生长发育过程中的作用,对大豆食心虫SpbHex基因进行克隆与表达分析。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆SpbHex的cDNA全长序列,并通过qPCR研究其在不同发育阶段和幼虫不同组织的表达情况。【结果】SpbHex基因cDNA序列全长2 161 bp,其中开放阅读框2 112 bp,编码703个氨基酸。蛋白预测分子量84.15 ku。hexamerin基因在大豆食心虫不同发育阶段和不同组织中均有表达。在不同生长发育阶段中4龄幼虫的表达量较高,1龄和成虫的表达量较低;在不同组织中脂肪体的表达量较高,表皮中的表达量最低。【结论】本研究克隆了大豆食心虫储存蛋白hexamerin基因,并对其在大豆食心虫中表达模式进行分析,为进一步明确hexamerin基因在大豆食心虫生长发育中的作用奠定基础。     

甘蓝型油菜BnCYP78A8的克隆及序列分析

采用Genome walking方法,首次克隆到甘蓝型油菜BnCYP78A8的基因组序列,根据基因特异性引物克隆到其编码序列。基因组序列长1 679bp,有1个内含子和2个外显子。编码序列长1 605bp,编码534个氨基酸。序列比对分析表明,其氨基酸序列与拟南芥细胞色素P450单加氧酶基因(AtCYP78A8)的相似度高达88%。生物信息学分析显示,该蛋白含有1个细胞色素P450特有的亚铁血红素配合基结合位点和1个跨膜结构域。实时荧光定量PCR分析结果表明,BnCYP78A8在甘蓝型油菜的各个器官组织均有表达,根中表达量最高,表明该基因可能参与根的生长发育。     

苹果黄蚜细胞色素P450基因AcCYP6CY14的表达及其在抵抗吡虫啉中的作用

【目的】研究苹果黄蚜Aphis citricola细胞色素P450基因AcCYP6CY14的表达及其在抵抗吡虫啉中的作用。【方法】搜索苹果黄蚜转录组数据库,获得细胞色素P450基因AcCYP6CY14的cDNA部分序列,采用RT-PCR技术克隆目的基因cDNA序列全长。利用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术测定目的基因在苹果黄蚜不同发育阶段的表达水平。采用浸虫法,用浓度为LC30的吡虫啉对苹果黄蚜3龄若蚜进行诱导,RT-qPCR检测吡虫啉诱导不同时间后P450基因的表达情况。利用RNA干扰(RNAi)技术沉默苹果黄蚜3龄若蚜的P450基因,并研究该基因沉默后,苹果黄蚜对吡虫啉的敏感性。【结果】获得苹果黄蚜细胞色素P450基因的cDNA全长序列,为1 542 bp,编码513个氨基酸,命名为AcCYP6CY14(GenBank登录号:MH717248)。研究发现该基因在苹果黄蚜各个发育阶段均有表达,在3龄若蚜中表达量最高。经吡虫啉诱导12 h后,该基因的相对表达量显著高于对照。dsRNA饲喂结果显示,苹果黄蚜取食ds AcCYP6CY14 24 h后,将其转接到新鲜的苹果嫩稍上,24、48、72 h后,该基因的表达量显著下调。沉默该P450基因后,苹果黄蚜对吡虫啉的敏感性极显著升高(P0.01),死亡率提高了65.2%。【结论】克隆得到了苹果黄蚜P450基因AcCYP6CY14的cDNA全长序列,该基因在苹果黄蚜整个生育期均有表达,且在3龄若蚜中表达量最高,推测该基因可能参与了苹果黄蚜对吡虫啉的解毒代谢。     

刺五加内生青霉鲨烯合酶基因的克隆与序列分析

【目的】克隆刺五加内生青霉Penicillium minioluteum P116-1a的鲨烯合酶(Squalene synthase,SS)基因。【方法】采用cDNA 5末端快速扩增(Rapid Amplification ofcDNA 5 Ends,5 RACE)技术扩增P.minioluteum P116-1a SS基因的全长cDNA序列和DNA序列;运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能;并通过RT-PCR法和SDS-PAGE法检测SS的表达情况。【结果】P.minioluteum P116-1a的SS基因含有4个外显子和3个内含子,开放阅读框长1 416 bp,编码471个氨基酸,预测蛋白含67.73%的α螺旋,5.31%的延伸链,2.97%的β折叠,23.99%的无规则卷曲,含有鲨烯合酶和八氢番茄红素合成酶的特异性识别区域,定位于内质网膜。与P.marneffei和Talaromyces stipitatus中SS蛋白的氨基酸同源性达90%以上。不同温度下SS的表达情况不同。【结论】首次在刺五加内生青霉P.minioluteum P116-1a中克隆到SS基因,为进一步研究P.minioluteum P116-1a提高刺五加皂苷含量的机制奠定基础。     

半滑舌鳎脑芳香化酶基因cDNA克隆及表达分析

为研究脑型芳香化酶(P450aromB)在半滑舌鳎性别分化中的作用,采用同源克隆策略,从半滑舌鳎脑分离了2184bp长的脑型芳香化酶的全长cDNA,该基因编码498个氨基酸。氨基酸序列和系统发育分析表明,P450aromB属于脑型P450arom,P450aromB的氨基酸序列与其他鱼类脑型P450arom的同源性较高(48.3%-66.1%),与性腺型P450arom的同源性较低(34.2%-49.9%),与自身的性腺型芳香化酶同源性为45.1%。RT-PCR分析表明:P450aromB mRNA的表达具有明显组织特异性,P450aromB只在性腺、脑、鳃和皮肤中表达,且脑中表达量远高于性腺,而在雌雄鱼的其他组织中都不表达。经过甲基睾酮浸浴处理和高温诱导半滑舌鳎由雌性性反转为雄性后,脑中P450aromB的表达量降低,这些结果表明P450aromB参与了半滑舌鳎的性腺分化和性别决定过程。     

飞蝗细胞色素P450基因LmCYP6FD3的表达及其在杀虫剂解毒中的作用

【目的】研究飞蝗Locusta migratoria细胞色素P450基因的分子特性和生物学功能。【方法】搜索飞蝗转录组数据库,获得细胞色素P450基因cDNA序列,采用RT-PCR技术克隆目的基因cDNA全长序列。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术测定其在飞蝗5龄若虫不同组织(胃盲囊、前肠、中肠、后肠、体壁、精巢、卵巢、肌肉、血淋巴、脂肪体和马氏管)中及不同发育阶段(卵、1-5龄若虫及成虫)的表达水平。采用RNA干扰(RNAi)技术沉默飞蝗2龄若虫细胞色素P450基因,检测基因的沉默效率,并研究该基因干扰后,2龄若虫对杀虫剂马拉硫磷、西维因和溴氰菊酯3种杀虫剂的敏感性。【结果】克隆获得飞蝗细胞色素P450基因的cDNA全长序列(Gen Bank登录号:KT316378),将其命名为LmCYP6FD3,其核苷酸序列全长为1 563 bp,编码521个氨基酸。研究发现该基因在飞蝗5龄若虫马氏管中高表达,其次是后肠和脂肪体中,在其他组织中的表达量相对较低;对LmCYP6FD3在飞蝗不同发育阶段的表达进行检测,发现该基因在飞蝗整个发育阶段均有表达,在若虫期表达量较高。RNA干扰结合杀虫剂生物测定结果表明,LmCYP6FD3在RNA干扰24 h时的沉默效率最高;2龄若虫点滴接触西维因,RNAi处理组(dsLmCYP6FD3注射组)与对照组(ds GFP注射组)相比,死亡率提高了32%。【结论】克隆获得飞蝗LmCYP6FD3的cDNA全长序列,该基因在飞蝗马氏管中高表达,并可能参与西维因在飞蝗体内的解毒代谢。     

刺五加皂苷合成关键酶基因表达的半定量RT-PCR分析

根据已克隆的刺五加鲨烯合酶(squalene synthase,SS)、鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)和β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,bAS)基因序列信息设计引物,通过半定量RT-PCR分析了SS、SE和bAS基因在刺五加不同生长发育时期和不同器官中表达量的变化.结果表明,SS、SE和bAS基因在各生长发育时期和各器官中均有表达,但表达量差异显著(P<0.05),三者均在盛花期表达量最高,之后降低,进入果实成熟期后SS和bAS的表达量迅速回升,SE无显著变化.SS和bAS在叶片和根中的表达量较高,SE表达量的最大值出现在叶片和幼茎中.刺五加SS、SE和bAS基因的表达间存在显著的正相关关系(P<0.05).研究结果为进一步分析关键酶基因对刺五加三萜皂苷生物合成的影响奠定了基础.     

核桃JrCBF基因的克隆与表达和单核苷酸多态性分析

根据CBF基因氨基酸保守序列设计简并引物,运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆核桃JrCBF基因cDNA全长序列。用实时荧光定量PCR分析JrCBF基因在低温胁迫下的表达模式,并分析JrCBF基因的单核苷酸多态性。结果获得长度为879 bp的CBF基因cDNA全长序列,编码214个氨基酸,命名为JrCBF;低温能诱导JrCBF基因的表达,4℃处理2 h后表达量开始增加,8 h后达到最大值;自然越冬条件下,JrCBF基因在花芽中表达量呈现先上升后下降的趋势,在寒冬时期(1月份)表达量最高;单核苷酸多态性分析JrCBF基因序列中有28个SNPs位点和7个Indels标记,存在2个突变热点区;单倍型分析显示15份材料可分为9个单倍型,单倍型多样性为0.9238。本研究为通过基因工程手段培育抗寒核桃品种和分子标记辅助育种提供了帮助。     

甘蓝型油菜BnCYP79B1基因的克隆与表达

硫苷是十字花科植物的一种次生代谢产物,其合成途径受细胞色素P450的CYP79家族蛋白的调控,该实验采用同源克隆技术在甘蓝型油菜中克隆到了CYP79B1基因,命名为BnCYP79B1(GenBank登录号为JX535391.1)。BnCYP79B1基因cDNA全长1 625bp,编码一个含有541个氨基酸、理论等电点为8.88。序列对比结果显示,BnCYP79B1与花椰菜CYP79B1在DNA序列上的相似性为98.83%,推测蛋白氨基酸序列的相似性为99.26%。通过不同时期不同部位BnCYP79B1基因表达量的分析,发现BnCYP79B1基因在高秆高硫苷品系的根中表达量较高,而对矮秆高硫苷品系则是叶中表达量较高。在BnCYP79B1表达总量上,高秆品系较矮秆品系高,高硫苷品系较低硫苷品系高。     

库尔勒香梨PsLOX基因克隆及生物信息学分析

克隆了库尔勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yü）脂氧合酶（lipoxygenase,LOX）基因PsLOX,了解其在香梨果实不同发育时期的表达差异,为香梨果实香气代谢机理研究提供理论依据。以库尔勒香梨嫩叶及不同时期果实表皮为试材,利用两种不同的方法提取总RNA,通过RT-PCR技术得到目的基因PsLOX的cDNA序列,以生物信息学方法对其进行分析和功能预测。运用半定量RT-PCR （SqRT-PCR）技术,分析PsLOX基因在香梨嫩叶及果实生长发育及货架期的表达特性和差异。结果：试剂盒提取总RNA质量较高,PsLOX基因CDS序列为912 bp,编码303个氨基酸,属于脂氧合酶家族基因,与其他植物LOX基因编码的氨基酸序列有较高的同源性,与南果梨相似性最高,达到99%;PsLOX基因在香梨果实中发育过程中表达差异明显,即生长发育前期表达量很低,成熟至完熟时期表达量最高,然后开始减少。推测克隆获得PsLOX基因在香梨果实香气代谢过程中起到重要作用。     

文蛤HDAC1基因克隆、时空表达及生长相关SNP位点筛查

为探索HDAC1基因在文蛤生长发育中的作用, 研究通过已构建的文蛤转录组文库, 利用SMARTRACE技术扩增得到文蛤HDAC1 (Mm-HDAC1)基因的cDNA全长序列, 分析了其生物信息学、组织及发育阶段表达特征, 并用直接测序法在外显子中筛查生长相关的SNP位点。结果显示, Mm-HDAC1基因的cDNA全长3065 bp, 开放阅读框1599 bp, 编码532个氨基酸; 氨基酸序列比对发现, 文蛤与其他物种同源性为74.3%78.7%。荧光定量PCR (qRT-PCR)结果表明, Mm-HDAC1基因在文蛤6个组织中均有表达, 其中外套膜中的表达量相对最高, 并与其他组织间有极显著差异(P0.01); 不同发育时期的表达差异结果表明, Mm-HDAC1基因在壳顶幼虫期表达量最高, 显著高于其他发育时期(P0.05)。SNP位点筛查结果表明, 在Mm-HDAC1基因的外显子区域发现了19个SNP位点, 其中有3个SNP位点(627AT、924TC和1266TC)与文蛤生长相关。     

半滑舌鳎脑芳香化酶基因cDNA克隆及表达分析

为研究脑型芳香化酶（P450aromB）在半滑舌鳎性别分化中的作用,采用同源克隆策略,从半滑舌鳎脑分离了2184 bp长的脑型芳香化酶的全长cDNA,该基因编码498个氨基酸。氨基酸序列和系统发育分析表明,P450aromB属于脑型P450arom,P450aromB的氨基酸序列与其他鱼类脑型Ｐ450arom的同源性较高（48.3%—66.1%）,与性腺型Ｐ450arom的同源性较低(34.2%—49.9%),与自身的性腺型芳香化酶同源性为45.1％。RT-PCR分析表明：P450aromB mRNA的表达具有明显组织特异性,P450aromB只在性腺、脑、鳃和皮肤中表达,且脑中表达量远高于性腺,而在雌雄鱼的其他组织中都不表达。经过甲基睾酮浸浴处理和高温诱导半滑舌鳎由雌性性反转为雄性后,脑中P450aromB的表达量降低,这些结果表明P450aromB参与了半滑舌鳎的性腺分化和性别决定过程。     

苎麻植物螯合肽合成酶(BnPCS1)基因的克隆和表达

根据苎麻转录组测序中的PCS基因片段,利用RT-PCR结合RACE技术从中苎1号中克隆获得了该基因的全长cDNA序列,命名为BnPCS1。该基因的cDNA序列全长为1956 bp,其中开放读码框长1512 bp,编码503个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为56.02 kD和7.01。与长喙田菁(ACT87974)、百脉根(Q2TSC7)、狼牙刺(AFM38979)、荷花(BAN08523)和杜梨(AEY68568)的PCS氨基酸序列相似性分别为74%、73%、75%、73%和77%。荧光定量PCR分析表明,BnPCS1在根、茎、茎尖、幼叶、成熟叶中均有表达,其中在成熟叶中的表达量最高,茎中表达量最低,并且该基因受镉和ABA诱导上调表达。BnPCS1基因的克隆将为苎麻抗重金属分子育种和进一步的功能分析奠定基础。     

西瓜牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的克隆及表达分析

目的:了解牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(GGPS)在4种不同瓤色西瓜果实发育过程中的表达变化,将为西瓜类胡萝卜素基因操作提供工具。方法:通过RT-PCR和RACE技术从西瓜果实中克隆GGPS的cDNA全长,用生物信息学方法分析其序列及推测氨基酸序列,并用实时定量PCR技术检测GGPS在不同瓤色果实发育过程的表达水平。结果:GGPS基因cDNA全长1 445 bp(GenBank登录号为KF914758),其开放阅读框为1 092 bp,编码363个氨基酸。预测其氨基酸序列N末端存在转运肽信号序列。西瓜GGPS与甜瓜和黄瓜GGPS的序列同源性高达90%以上。GGPS在红瓤西瓜中的表达量最高,白瓤西瓜中最低。结论:克隆获得的GGPS可能对西瓜果实中类胡萝卜素的积累具有重要影响。     

黄秋葵查尔酮合成酶基因AeCHS的克隆与表达分析

采用同源序列克隆和RT-PCR技术,首次克隆得到黄秋葵查尔酮合成酶基因(CHS)cDNA全长序列。序列分析表明,该序列全长1175 bp,包括一个1170 bp的完整ORF,编码389个氨基酸,命名为AeCHS。生物信息学分析表明,本研究所获得的AeCHS氨基酸序列与同科植物黄蜀葵和陆地棉的同源性较高,分别达99.23%和97.44%,AeCHS推断的氨基酸序列含有CHS蛋白的标签序列GFGPG以及4个保守活性位点Cys164、Phe215、His303、Asn336。实时荧光定量PCR分析黄秋葵果实、花、叶片不同发育时期AeCHS基因的表达量,结果表明AeCHS基因在上述植物材料中表现出不同的表达模式:花>果实>叶片,具体到不同植物组织,AeCHS基因在生长6 d的果实、盛开的花朵以及植株顶端第4片叶子中的表达量较高。