658 nm低能量激光照射对人牙周膜细胞生物学效应的影响

目的:探讨658 nm低能量激光照射对人牙周膜细胞增殖、碱性磷酸酶活性及纤维连接蛋白合成的影响.方法:改良组织块法体外培养人牙周膜细胞.通过658 nm激光照射人牙周膜细胞,观察能量密度为1.86 J/cm2和3.72 J/cm2激光照射后不同时间点细胞增殖效应、碱性磷酸酶活性和纤维连接蛋白的变化.结果:1.86 J/cm2和3.72 J/cm2能量密度的激光照射人牙周膜细胞,可显著促进细胞增殖效应.3.72 J/cm2能量密度的激光照射可提高人牙周膜细胞碱性磷酸酶活性;能量密度为1.86 J/cm2的激光照射人牙周膜细胞72 h后,细胞中纤维连接蛋白分泌量增加.结论:658 nm低剂量激光照射可促进人牙周膜细胞增殖;适量的低剂量激光照射人牙周膜细胞可促进其碱性磷酸酶活性及纤维连接蛋白的分泌.     

Tie-2单克隆抗体鉴定人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化的内皮细胞

目的:体外扩增和定向诱导成人骨髓间充质干细胞(MSCs)向内皮细胞分化,并探讨其可行性和条件.方法:利用Percoll(1 073 g/L)从正常成人骨髓中分离MSCs,用含10?S的LG-DMEM培养基进行纯化和扩增培养,流式细胞仪分析鉴定MSCs的纯度.用含VEGF(10μg/L)的HGDMEM培养基诱导MSCs向内皮细胞定向分化,Tie-2单克隆抗体的免疫组化法和透射电镜(TEM)鉴定其细胞的性质.结果:5.0×105个MSCs在体外扩增15代后,获得了8.0×1012个MSCs,扩增了约1.6×107倍.加入诱导培养体系培养14～21 d,光镜下可观察到内皮细胞呈典型的"鹅卵石"样:90%的细胞Tie-2免疫组化呈阳性反应;TEM下可观察到胞浆内有Weible-palade小体.结论:成人骨髓MSCs在体外具有定向诱导分化为内皮细胞的潜能,为构建心脏组织工程瓣种子细胞的来源提供了可能性.     

人外周血纤维细胞的分离、培养方法

目的:探索简便易行的外周血纤维细胞体外分离、培养方法极其生物学特征与功能.方法:采用Ficoll密度梯度离心分离法分离成人外周血,所获得的白细胞在一定条件要求下体外培养,采用流式细胞技术、细胞免疫荧光染色等对贴壁生长的成纤维样细胞进行鉴定,在扫描电镜下进一步观察其形态结构.结果:培养至第14天时,外周血纤维细胞开始分化成熟.血液来源的取材、首次换液的时间、细胞的接种密度、血清浓度等多种因素均会对外周血纤维细胞的培养造成影响.免疫荧光染色结果显示培养至12天时CD34和COL Ⅰ均为强阳性表达,继续培养至28天时,血液来源的细胞表面抗原CD34发生明显丢失,免疫荧光染色几乎不能显色;相反COL Ⅰ持续表达阳性,取培养14天的贴壁细胞,经流式细胞仪分析,Col Ⅰ+细胞为81.6％,显示PBFCs不断向成纤维细胞分化的特性.结论:采用密度梯度离心法配合适当的培养条件,成人外周血中存在的前体细胞经体外分离、培养可分化为外用血纤维细胞,并保持其生物学特性.     

他汀类药物对外周血内皮祖细胞的影响

本文旨在探讨他汀类药物氟伐他汀对外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)数量和功能的影响.用密度梯度离心从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白(human fibronectin)包被的培养板中,培养7 d后,收集贴壁细胞,加入不同浓度氟伐他汀(分别为0.01、0.1、1、10μmol/L)和辛伐他汀(1 μmol/L),培养一定的时间(6、12、24、48 h).用激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-I和DiI-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,用流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定EPCs,在倒置荧光显微镜下计数.采用MTT比色法、改良的Boyden小室、粘附能力测定实验和体外血管生成试剂盒观察EPCs的增殖能力、迁移能力、粘附能力和体外血管生成能力.结果显示,氟伐他汀可显著增加外周血EPCs的数量,并且EPCs数量随氟伐他汀浓度增加及作用时间延长而增加,1 μmol/L浓度氟伐他汀作用24h对EPCs的数量影响最为显著(较对照组增加15倍,P＜0.05).在动物实验中,喂养氟伐他汀3周后,大鼠的EPCs也较对照组增加2倍(P＜0.05),进一步支持了体外实验的结果.氟伐他汀和辛伐他汀也显著改善外周血EPCs的粘附能力、迁移能力、增殖能力和体外血管生成的能力,相同浓度的氟伐他汀和辛伐他汀(1 μmol/L)对EPCs数量和功能的影响并无显著差异.上述观察结果提示他汀类药物可增加EPCs的数量,改善EPCs功能.     

大鼠脊髓匀浆上清诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:观察大鼠脊髓匀浆上清诱导骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)形成的神经元样细胞形态特征.方法:通过贴壁法培养分离大鼠骨髓MSCs,体外扩增纯化后加入正常大鼠脊髓匀浆上清诱导72h,倒置显微镜下观察诱导前后细胞的形态结构.激光共聚焦显微镜观测钙离子细胞形态和荧光强度变化,免疫细胞化学方法鉴定诱导后细胞的表型特征.结果:倒置显微镜下可见MSCs呈纺锤形和多角形,核居中,有1-2个核仁,诱导后细胞呈神经元样,细胞伸出较长的轴突样和树突样突起.免疫细胞化学法显示NSE(神经元特异性烯醇化酶)、NF(神经丝蛋白)阳性,GFAP(神经胶质细胞酸性蛋白)阴性.共聚焦显微镜扫描脊髓匀浆上清诱导前细胞形态呈细长的梭形,细胞核不明显,胞体染色强,突起染色弱,荧光像素值低;诱导后,细胞呈现神经元样形态,胞体大,有多个突起,胞体及各突起染色强,荧光像素值高.结论:大鼠脊髓匀浆上清液可在体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞.     

激光共聚焦显微镜在肿瘤免疫治疗检测中的应用

目的:通过激光共聚焦显微镜对肿瘤生物治疗后患者的外周血淋巴细胞进行亚群计数,为生物治疗后外周血淋巴细胞无法分群的肿瘤患者提供新的监测免疫功能状态的方法。方法:收集35例肿瘤生物治疗后患者的外周血标本,通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪两种方法分别对患者外周血淋巴细胞亚群进行分类计数。结果:流式细胞仪和激光共聚焦显微镜同时分类计数的患者外周血细胞标本30例,两种方法在检测CD3、CD3~+/CD4~+、CD3~+/CD8~+、CD3-/CD16~+56~+、CD3-/CD19~+细胞时均无统计学差异(P值0.05);5例流式细胞仪无法将患者外周血淋巴细胞分群的样本,通过激光共聚焦显微镜可以进行分类计数。结论:激光共聚焦显微镜亦可以用于外周血淋巴细胞的分类计数。     

携抗MUC1单克隆抗体的超声造影剂微泡制备及体外寻靶实验

目的:制备携抗MUCI单克隆抗体的超声造影剂微泡,并评价其体外寻靶能力。方法:采用异型双功能交联剂将小鼠抗MUCI单克隆抗体与超声造影剂微泡相结合,采用激光粒度仪,扫描电镜及激光共聚焦显微镜评价其粒径,形态及结合率。体外培养小鼠EMT6细胞,将其与靶向微泡相混合,激光共聚焦显微镜评价粘附能力。结果:扫描电镜下显示携抗MUCI单克隆抗体造影剂微泡呈规则球体形态,平均粒径2.88±1.34μm,通过异型双功能交联剂,抗MUC1单克隆抗体可结合至超声造影剂微泡表面,其结合率为77.3±10.4%,靶向造影剂粘附体外培养细胞比例为79.2±13.2%。结论:成功制备携抗MUCI的靶向超声造影剂微泡,并且能很好的识别粘附体外培养乳腺癌细胞。     

人脐带血间充质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的:探讨并建立稳定可靠的人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hUCBMSCs)体外分离和培养方法.方法:采用密度梯度离心法分离脐带血单个核细胞,利用MSC易黏附塑料贴壁生长的特性,分离MSC并进行体外扩增培养,观测其形态学特征,绘制不同代数hUCBMSC生长曲线,流式细胞技术检测细胞表面标志物CD29、CD34、CD105、HLA-DR等表达情况.结果:本法可成功、可靠地在体外自hUCB中分离培养出粘附细胞,该细胞在体外培养呈梭形或成纤维样,其指数生长倍增时问约为36h,其细胞表面表达β1整联蛋白CD29、CD105(endoglm),不表达造血细胞标志物CD34以及HLA-DR.结论:人脐带血中存在问充质干细胞,采用优化的实验方法可以提高培养成功率,稳定获得MSC并体外扩增培养.人脐带血可以作为获得间充质干细胞稳定充足的来源.     

大鼠p75NTR荧光真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:构建大鼠p75神经营养素受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)cDNA序列的绿色荧光真核表达载体并鉴定其在人胚肾293(human embryo kidney 293,HEK293)细胞中的表达.方法:采用PCR方法从含野生型大鼠p75NTR的pDC316-RP75质粒中扩增目的片段,经EcoRⅠ和SaⅡ双酶切,定向克隆于pEGFP-N1质粒中,构建绿色荧光真核表达栽体pEGFP-N1-RP75,经酶切及测序鉴定后,通过脂质体转染HEK293细胞,激光共聚焦及免疫组织化学法鉴定大鼠p75NTR的表达.结果:重组质粒经酶切鉴定和序列分析证实含有大鼠p75NTR的编码序列,转染后经激光共聚焦显微镜及免疫组织化学染色观察表明重组质粒能够在HEK293细胞中表达出具有活性的大鼠p75NTR片段.结论:大鼠p75NTR绿色荧光真核表达栽体构建成功并可在HEK293细胞中表达,为进一步研究奠定了基础.     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性观察

目的:探讨兔骨髓间充质干细胞体外分离、培养和鉴定方法,观察其生物学特性.方法:采集兔股骨及胫骨骨髓组织,采用密度梯度离心法结合贴壁培养法体外分离、培养和扩增兔骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态,绘制原代、第1、3、8代细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面标志物,成骨和成脂肪诱导培养鉴定,观察细胞生物学特性.结果:培养的BMSCs呈纺锤形、长梭形,旋涡状排列、放射性生长,增值活跃.各代细胞生长曲线呈S型,细胞增值活跃.细胞表面标志物CD44分子阳性,CD34和CD45分子阴性.经成骨和成脂肪诱导后细胞碱性磷酸酶染色和油红O染色阳性.结论:成功建立了兔BMSCs体外分离、培养的有效方法,扩增的BMSCs仍保留多向分化潜能,是理想的组织工程种子细胞.