囊泡相关膜蛋白A调控牛病毒性腹泻病毒复制

[背景]牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是致犊牛腹泻的重要病原之一,而目前BVDV与宿主因子互作机理研究较少,成为限制BVDV防控的重要原因。[目的]探明囊泡相关膜蛋白A (vesicle-associated membrane protein A,VAPA)对BVDV复制的影响。[方法]根据GenBank中VAPA基因,使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向VAPA的向导RNA(small guide RNA,sgRNA),融合后克隆至慢病毒lentiCRISPR v2载体中,包装慢病毒后感染牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK),使用嘌呤霉素连续筛选5代,使用Western Blot检测VAPA蛋白敲除(knockout,KO)情况;BVDV感染VAPA KO细胞不同时间后,收集细胞提取总RNA,并将等质量的RNA反转录成cDNA,使用实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫荧光分析(immunofluorescence a...     

细胞病变型牛病毒性腹泻病毒对宿主细胞自噬作用的研究

细胞自噬(Autophagy)是一种真核生物细胞内损伤的细胞器和长寿命蛋白通过双层膜结构的自噬小泡包裹后,送入溶酶体或液泡中进行降解并得以循环利用的高度保守的分解代谢过程。本研究旨在了解细胞病变型(CEP)牛病毒性腹泻病毒(BVDV NM)对宿主细胞MDBK细胞自噬作用的影响。实验使用BVDV NM株感染宿主细胞MDBK,在不同时间点分别通过透射电镜观察自噬体形成、报告荧光GFP-LC3自噬底物检测以及Western blot方法鉴定细胞自噬标记物LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ和P62的表达等试验方法对自噬进行检测。结果显示,感染BVDV NM株的MDBK细胞出现了明显的细胞病变;透射电镜能观察到细胞中存在大量的双层膜结构的自噬泡;转染GFP-LC3荧光质粒后,在感染病毒的细胞内出现增多的聚集绿色荧光自噬小体;此外,随着BVDV NM株感染MDBK时间的延长可以发现LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白的量逐渐增加以及P62蛋白的降解。试验表明BVDV NM株感染MDBK可以促进细胞自噬的发生。     

牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体诱发细胞焦亡的研究

【目的】牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)是引起牛病毒性腹泻-黏膜病的关键病毒。BVDV的结构蛋白Erns可在病毒感染的初期削弱宿主的免疫防御,引发牛群炎症反应。核苷酸寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain, NOD)热蛋白结构域相关蛋白3 (NLRP3)炎症小体是NOD样受体(NOD-like receptor, NLRs)家族重要成员,调控炎症性疾病的发生发展,同时激活的NLRP3炎症小体能够引起宿主细胞焦亡,进而诱发级联放大的炎症反应。但BVDV Erns蛋白在BVDV感染诱发炎症反应的分子机制尚不清楚。【方法】为进一步探索Erns蛋白对BVDV感染激活NLRP3炎症小体诱发细胞焦亡的影响,构建了BVDV Erns蛋白的真核表达质粒pCMV-HA-Erns,过表达BVDV Erns蛋白,检测BVDV感染细胞中NLRP3炎症小体组分[半胱氨酸蛋白酶(caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC)和NLRP3]、IL-1β的mRNA转录水平和蛋白表达水平,以及细胞死亡调节蛋白(gasdermin D, GSDMD)的基因表达和蛋白剪切情况,并通过扫描电镜观察牛睾丸(bovine testis, BT)细胞膜成孔及BT细胞内容物释放情况,以分析Erns蛋白诱导BT细胞产生细胞焦亡。【结果】Erns蛋白能够显著引起NLRP3炎症小体活化进而激活caspase-1,活化的caspase-1一方面切割GSDMD,形成有活性的GSDMD-N端并在BT细胞膜形成孔洞,释放内容物,诱导BT细胞发生细胞焦亡;另一方面活化的caspase-1切割pro-IL-1β,形成有活性的IL-1β,并释放到BT细胞外,引起BT细胞上清中IL-1β水平上升。【结论】系统解析了BVDV Erns蛋白激活NLRP3炎症小体介导细胞焦亡的产生,对疫苗及治疗药物的研制具有重要指导意义。     

牛源材料中BVDV检测方法的验证及应用

目的对生物制品生产过程中使用的牛源材料(牛血清、牛源细胞等)进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)检测以保证制品的生物安全性。方法参照制药质量体系Q10(ICH Q10)对杂质的定性检测要求,采用一步法RT-PCR检测BVDV的5'-UTR保守区,并对其特异性、敏感性和重复性进行验证,然后将其应用于牛源材料中BVDV的检测。结果扩增产物为250 bp的目的片段,测序后经序列比对分析软件BLAST比对,同源性达99%,且与其他5种牛源病毒均无相关性;敏感度达1CCID50/m L。应用该方法对牛血清、牛鼻甲骨细胞(BT)、牛肾原代细胞、MDBK细胞等样品进行检测,15份为阳性,阳性检出率为12%。结论一步法RT-PCR检测BVDV,特异性强、重复性好、敏感性高,可用于牛源材料中BVDV的快速检测。     

牛病毒性腹泻病毒Erns-E2融合蛋白在果蝇S2细胞中的表达与鉴定

目的:利用果蝇S2细胞表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Erns-E2融合蛋白,并对其抗体结合能力进行鉴定.方法:用RT-PCR方法扩增BVDV NADL株Erns和E2蛋白的编码基因,利用(G4-S)3柔性15肽基因将扩增的2个基因连接,再与昆虫表达载体pMT/BiP/V5-His连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5-His-E(MS)-E2,将后者与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞后表达Erns-E2融合蛋白.并对表达产物进行鉴定.结果:SDS-PAGE结果表明,融合蛋白相对分子质量为76 800;Westem blotting检测表明,该融合蛋白具有与BVDV抗体良好的结合能力.结论:BVDV的Erns-E2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行表达;经鉴定,表达产物具有良好的抗体结合能力,可用于抗原检测.     

牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白的中华仓鼠卵巢细胞表达及免疫原性分析

本研究利用中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV) E^rns蛋白,并分析其免疫原性。以BVDV-1 NADL标准毒株基因序列为基础,构建BVDV E^rns蛋白重组真核表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E^rns,转染悬浮培养的CHO细胞,进行上清分泌表达。SDS-PAGE分析E^rns蛋白的表达和纯化,并用抗His单克隆抗体和BVDV阳性血清进行Western blotting鉴定纯化蛋白;进一步使用纯化的E^rns蛋白免疫新西兰大白兔,通过间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和细胞间接免疫荧光(indirect immunofluorescence,IFA)实验检测血清抗体水平及其免疫反应活性,用病毒中和实验测定免疫兔血清的中和抗体滴度。BCA蛋白定量试剂盒检测纯化的E^rns     

人中性粒细胞多肽HNP1，3体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型的作用

体外观察人中性粒细胞多肽1,3(Humanneutrophilpeptide,HNP1,3)及阿昔洛韦(Acyclovir,ACV)对单纯疱疹病毒-Ⅰ型(Herpessimplexvirus1,HSV-1)的抑制作用。以Vero细胞为靶细胞,用各种浓度HNP1,3与游离病毒颗粒(直接失活组)及感染病毒后的靶细胞(复制抑制组)进行相互作用,镜下观察各药物对HSV-1致细胞病变效应的抑制作用,并采用ELISA法测定感染48h后药物对HSV-1囊膜糖蛋白分泌的抑制作用。MTT法检测各药物对细胞的毒性作用。结果显示直接失活组中,HNP1,3可使HSV-1的致细胞病变效应减轻,对HSV-1直接失活的50%有效浓度(EC50)为8.1μg/mL、10.03μg/mL;复制抑制组中,ACV使HSV-1的致细胞病变效应减轻,EC50为0.68μg/mL。MTT检测结果表明HNP1,3在治疗浓度范围内无明显细胞毒性。以上结果表明HNP1,3除具有较强的抗菌作用和抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(Humanimmunodeficiencyvirus1,HIV-1)活性外,还能失活HSV-1病毒颗粒,从而逆转病毒及其蛋白的病毒效应(致细胞病变)和抑制病毒蛋白质的合成。     

牛病毒性腹泻病毒生物型的遗传基础

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是黄病毒科、瘟病毒属成员,主要引起牛免疫抑制、腹泻及繁殖障碍,是影响全球养牛业的重要致病原。根据BVDV在体内对细胞的致病性,目前普遍将其分为2种生物型。不同生物型的基因结构及分子致病学机制明显不同,病毒基因变异可能产生新的生物型致病。我们简要综述BVDV生物型与基因结构及疾病发生之间的关系。     

人中性粒细胞多肽HNP1,3体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型的作用

体外观察人中性粒细胞多肽1,3(Human neutrophil peptide,HNP1,3)及阿昔洛韦(Acyclovir,ACV)对单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus 1,HSV-1)的抑制作用.以Vero细胞为靶细胞,用各种浓度HN1,3与游离病毒颗粒(直接失活组)及感染病毒后的靶细胞(复制抑制组)进行相互作用,镜下观察各药物对HSV-1致细胞病变效应的抑制作用,并采用ELISA法测定感染48h后药物对HSV-1囊膜糖蛋白分泌的抑制作用.MTT法检测各药物对细胞的毒性作用.结果显示直接失活组中,HNP1,3可使HSV-1的致细胞病变效应减轻,对HSV-1直接失活的50%有效浓度(ECs0)为8.1μg/mL、10.03μg/mL;复制抑制组中,ACV使HSV-1的致细胞病变效应减轻,EC5o为0.68μg/mL.MTT检测结果表明HNP1,3在治疗浓度范围内无明显细胞毒性.以上结果表明HNP1,3除具有较强的抗菌作用和抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(Human immunodeficiency virus 1,HIV-1)活性外,还能失活HSV-1病毒颗粒,从而逆转病毒及其蛋白的病毒效应(致细胞病变)和抑制病毒蛋白质的合成.     

牛病毒性腹泻病毒的初步鉴定

近年来,我们在内蒙羔羊下痢病流行区采集到一株牛病毒性腹泻病毒。83年到85年间,对内蒙三盟,二市,六旗(县),二个良种场的229份病粪样做了病毒检测,其阳性率达59％。该病毒粒子为直径40—80nm,具有囊膜的球形颗料。且与BVDV(牛病毒性腹泻病毒)的NADL株及Danish株有共同抗源。该病毒感染羔羊已传至22代,经补体结合反应测定,其效价提高了6倍。病羔羊的解剖病变观察,说明有病毒性肠炎的病变。病羊的恢复期血清测定为阳性。根据上述结果,我们初步鉴定该病毒为BVDV的一个株,暂命为BVDV的1nL株。     

我国牛病毒性腹泻流行现状与防控策略

我国牛病毒性腹泻病(Bovine viral diarrhea,BVD)的流行比较复杂,其病原BVDV (BVDV-1和BVDV-2)不仅仅局限于已知易感动物牛群感染,其他动物种群中感染BVDV-1和BVDV-2的现象也值得注意,如猪群中BVDV感染很大程度上混淆了猪瘟等病原的监测,从而加剧病程发展。牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)可致持续感染(Persistent infection,PI),这一特性导致该病的净化面临巨大困难,对整个养殖场的健康发展形成了严峻威胁。BVDV抗原变异速率非常快,目前BVDV-1已有22个亚型,BVDV-2有4个亚型,鉴于病原在自然界的适应和演进特性,对该病的防控措施迟后其病原的变异速度。因此,定期摸清BVDV-1和BVDV-2在我国的流行现状是实施疫病净化的第一步和关键步骤,进一步借鉴国外BVD净化成功经验,综合考虑我国国情,采取适宜的防控策略,逐步净化该病原感染,有助于促进国内养殖业的健康发展。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)糖蛋白E2单克隆抗体(MAb),利用原核表达并且纯化的重组糖蛋白E2(rE2)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.采用以BVDV为检测抗原的间接ELISA筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得2株稳定分泌抗E2特异性MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为4E3与1G11.用4E3与1G11杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠制备腹水,采用rE2及BVDV包被的ELISA测得的效价分别是6.21×106和6.83×105及6.83×105和7.5×104.间接ELISA、Western blot、IFA试验表明两株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性.经抗体亚类鉴定4E3与1G11均为IgM/K.特异性试验表明4E3与1G11这2株MAb均不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛腺病毒3型反应;其中4E3不与猪瘟病毒反应,而1G11则可与猪瘟病毒发生交叉反应,这种反应特性可试用于BVDV与猪瘟病毒的鉴别诊断.所制备的4E3与1G11 MAb可以用于BVDV抗原的检测,为建立检测BVDV E2蛋白血清抗体的ELISA奠定了基础.     

分泌表达牛病毒性腹泻病毒E0蛋白MDBK细胞的稳定性分析

目的:构建分泌表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0蛋白的MDBK细胞系,并探究其传代和冻存稳定性。方法:用实验室制备的BVDV E0基因重组慢病毒感染MDBK细胞,荧光观察并收集MDBK细胞培养上清进行Western印迹分析,通过qPCR方法检测重组细胞系中重组基因拷贝数变化。结果:IgK信号肽组和预测信号肽组均分泌表达E0蛋白;通过Oligo6.0软件设计BVDV E0基因SYBR GreenⅠ染料法荧光定量PCR检测引物,经过条件优化,未出现非特异性扩增,检测下线为20拷贝/μL;通过建立的荧光定量PCR和流式分析对2组细胞系进行传代稳定性分析,结果2组细胞系在第12代之后荧光率显著下降,15代之后E0基因拷贝数显著下降,2组细胞冻存前后荧光率未发现显著变化。结论:构建了稳定分泌表达BVDV E0蛋白的MDBK细胞系,建立了BVDV E0基因定量检测方法,为研究E0蛋白的生物学功能、探索BVDV的防控措施以及开发基因工程诊断抗原和基因工程亚单位疫苗奠定了基础。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒感染的细胞培养系统的建立

目的:建立稳定的HSV-1感染的细胞培养系统,为HSV-1感染性皮肤病的基础及临床研究提供稳定的平台。方法:以猴肾细胞(Vero)为繁殖细胞,选择人鼻咽癌上皮细胞(Hep-2)为靶细胞,观察HSV-1在Hep-2株中的致细胞病变效应(CPE)。结果:HSV-1在Vero细胞中能稳定、大量地繁殖;HSV-1感染Hep-2细胞后可出现明显的细胞病变;结论:以Vero为繁殖细胞,Hep-2为靶细胞的稳定的细胞培养系统可作为HSV-1感染性皮肤病的基础及临床研究的平台。     

牛BVDV C_(24)V株P80蛋白在大肠杆菌中的高效表达

根据GenBank中已发表的牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)P80基因序列,自行设计并合成引物,经过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从BVDV C_(24)V株细胞培养液中扩增出P80基因,大小为560bp。利用酶切方法把目的基因克隆到大肠杆菌IPTG诱导表达载体PET32a(+)中,在大肠杆菌中得到了高效表达,这为建立ELISA方法检测BVDV抗体奠定了基础。     

蓝舌病毒HbC3株对小鼠乳腺癌MA-782细胞的感染特性

体外研究蓝舌病毒湖北株3(BTV-HbC3)对鼠乳腺癌细胞MA782的感染性并探讨BTV-HbC3靶向性溶癌的机制.观察MA782细胞感染BTV-HbC3的病变效应(CPE);MTT法研究病毒致细胞病变率的特征;透射电镜观察感染病毒后细胞超微结构的变化;免疫组化研究病毒蛋白在细胞内的表达特点;凋亡染色(TUNEL法)观察病毒诱导细胞凋亡的情况;流式细胞仪测定病毒对MA782细胞周期的影响.结果证明BTV-HbC3感染MA782细胞后有明显的细胞病变效应;病毒蛋白主要表达在细胞的胞膜及胞浆内;凋亡染色发现大量的凋亡细胞;流式细胞仪可见明显的亚二倍体峰.故认为BTV-HbC3在体外能有效的感染MA782细胞,并能诱导MA782细胞凋亡.     

蓝舌病毒HbC3株对小鼠乳腺癌MA-782细胞的感染特性

体外研究蓝舌病毒湖北株3(BTV-HbC3)对鼠乳腺癌细胞MA782的感染性并探讨BTV-HbC3靶向性溶癌的机制。观察MA782细胞感染BTV-HbC3的病变效应(CPE);MTT法研究病毒致细胞病变率的特征;透射电镜观察感染病毒后细胞超微结构的变化;免疫组化研究病毒蛋白在细胞内的表达特点;凋亡染色(TUNEL法)观察病毒诱导细胞凋亡的情况;流式细胞仪测定病毒对MA782细胞周期的影响。结果证明BTV-HbC3感染MA782细胞后有明显的细胞病变效应;病毒蛋白主要表达在细胞的胞膜及胞浆内;凋亡染色发现大量的凋亡细胞;流式细胞仪可见明显的亚二倍体峰。故认为BTV-HbC3在体外能有效的感染MA782细胞,并能诱导MA782细胞凋亡。     

重组鸡γ_干扰素在昆虫细胞中的高效表达

将鸡γ-干扰素(ChIFN-γ)基因克隆到载体pFASTBAC1中,构建转移载体pFASTBAC1-ChIFN-γ,然后转化DH10Bac感受态大肠杆菌,通过位点特异性转座,将ChIFN-γ基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建表达质粒Bacmid-ChIFN-γ;通过脂质体将表达质粒转染Sf9昆虫细胞,用间接免疫荧光试验鉴定重组鸡γ-干扰素(rChIFN-γ)的表达;通过水泡性口炎病毒感染鸡胚成纤维细胞(CEF)的细胞病变抑制试验,检测rChIFN-γ的活性。研究结果表明,感染重组杆状病毒的Sf9细胞能高效表达rChIFN-γ,且当每个细胞的感染量为1个病毒时,细胞在感染96h后,rChIFN-γ基因表达产物的活性最高,达到106~107.2U/mL。以rChIFN-γ进行对新城疫病毒(NDV)F48E8株、禽流感H5N1病毒(AIV-H5)和马立克氏病病毒(MDV)GA株的抗病毒活性试验,发现rChIFN-γ对AIV-H5和MDV GA株病毒有明显的抑制其致细胞病变作用,但对NDVF48E8株病毒在体外不能抑制其致细胞病变作用,仅能在病毒滴度上表现抑制效果。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的研究

牛病毒性腹泻——粘膜病是世界性广泛流行的奶牛和肉牛的传染病。其病原为牛病毒性腹泻病毒(BVDV),属于披膜病毒科的瘟病毒属,它的许多生物学特性至今还不很清楚。本试验建立了12株分泌抗BVDV的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,并结合免疫转移电泳法和放射免疫沉淀法,初步研究了BVDV的多肽。     

牛病毒性腹泻病毒E^rns-E2融合蛋白在果蝇S2细胞中的表达与鉴定

目的：利用果蝇S2细胞表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）Erns-E2融合蛋白,并对其抗体结合能力进行鉴定。方法：用RT-PCR方法扩增BVDV NADL株Erns和E2蛋白的编码基因,利用（G4-S）3柔性15肽基因将扩增的2个基因连接,再与昆虫表达载体pMT/BiP/V5-His连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5-His-Erns-E2,将后者与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞后表达Erns-E2融合蛋白,并对表达产物进行鉴定。结果：SDS-PAGE结果表明,融合蛋白相对分子质量为76800;Western blotting检测表明,该融合蛋白具有与BVDV抗体良好的结合能力。结论：BVDV的Erns-E2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行表达;经鉴定,表达产物具有良好的抗体结合能力,可用于抗原检测。