(S)-羰基还原酶II于酿酒酵母孢子中表达与功能

摘要:【目的】使近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(S) -羰基还原酶II 表达并包埋于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae AN120)孢子中,实现了重组酶高效催化生产(S) -苯基乙二醇的转化过程。【方法】采用PCＲ 扩增技术,从近平滑假丝酵母基因组中克隆(S) -羰基还原酶II 基因,于酿酒酵母AN120中表达,以醋酸钾为唯一碳源诱导培养产生孢子,包埋(S)-羰基还原酶II。以该孢子为生物催化剂,2-羟基苯乙酮为底物进行生物转化反应,经HPLC分析,计算产物的光学纯度和得率。考察了孢子催化转化反应的最适温度和pH值,温度和pH 稳定性以及多批次使用性能。【结果】在最适反应温度40℃和pH6.0条件下,10%(W/V)子囊孢子催化6 g/L 2-羟基苯乙酮,产物(S) -苯基乙二醇的光学纯度和得率均高达99%以上。与重组大肠杆菌相比较,重组孢子合成(S)-苯基乙二醇的得率由89.7% 提高到99.0%,反应时间由48 h缩短为4 h;连续使用10批次后,其催化产物的光学纯度几乎不变,得率保持在85%以上。【结论】该研究首次实现了氧化还原酶在酵母孢子内的异源表达,为手性化合物的高效制备奠定了坚实的研究基础。     

(S)-羰基还原酶Ⅱ与葡萄糖脱氢酶共催化高效合成(S)-苯乙二醇北大核心CSCD

【目的】通过优化获得最佳酶活配比,设计近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011的(S)-羰基还原酶Ⅱ与枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)YX-1葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中的共表达体系,实现重组菌高效催化2-羟基苯乙酮,合成(S)-苯乙二醇。【方法】分别从重组大肠杆菌中纯化了(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶,研究了2种酶共催化2-羟基苯乙酮的最佳酶活比例,最适催化温度和pH,由此构建(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶的共表达体系。【结果】(S)-羰基还原酶Ⅱ的比酶活力为1.3 U/mg,葡萄糖脱氢酶的比酶活力为13.5 U/mg。在总酶活力为1 U时,(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶共催化体系中,确定了2种酶的最佳比例在1∶1到5∶1(U/U)之间,最适反应温度为30℃,pH为7.0。在此基础上构建了(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶基因比为1∶1的共表达体系,共表达重组菌破碎上清液中(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶酶活分别为0.76 U/mg和0.73 U/mg,两者的酶活比例为1∶1。在上述确定的最适催化条件下,其催化10 g/L 2-羟基苯乙酮,产物(S)-苯乙二醇的光学纯度和得率均高达99%以上。与仅含有(S)-羰基还原酶Ⅱ的重组大肠杆菌相比,共表达体系转化产物(S)-苯乙二醇的得率明显提高,且转化时间由原来的24 h缩短为13 h。【结论】通过确定(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶最佳酶活配比,为构建手性催化的靶酶和辅酶再生酶共表达体系,为实现手性化合物的高效制备提供了研究基础。     

一种新型(S)-羰基还原酶的克隆及其功能表达

【目的】从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)基因组中钓取新型(S)-羰基还原酶基因(scrⅡ),对其生物转化手性醇的功能进行了验证。【方法】采用PCR的方法,从C.parapsilosis基因组中扩增出一段可能的羰基还原酶基因scrⅡ。以构建的重组菌Escherichia coli BL21/pET28a-scrⅡ为生物催化剂,2-羟基苯乙酮为底物进行催化反应,经HPLC分析,计算终产物的光学纯度和产率,确定了转化反应的最适温度和pH值。【结果】scrⅡ基因全长为840bp,编码279个氨基酸,与已报道的(S)-羰基还原酶基因scr的一致性为85%。氨基酸序列分析表明SCRⅡ具有典型短链醇脱氢酶的功能域:辅酶结合区域Thr40-Gly41-(X)3-Gly45-X-Gly47和催化三联体结构Ser172-(X)n-Tyr187-(X)3-Lys191。在30℃,0.1mmol/LIPTG的诱导下,(S)-羰基还原酶(SCRⅡ)在E.coli中过量表达。以10%(w/v)的重组菌为催化剂,高浓度(6g/L)2-羟基苯乙酮为底物,在最适反应温度35℃和pH5.5的条件下,转化产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度高达99.1%e.e.,产率为89.6%。与(S)-羰基还原酶SCR相比较,底物浓度提高了一倍,产物的光学纯度和产率分别提高了10%和28%。【结论】采用分子克隆技术分离出新型羰基还原酶SCRⅡ的编码基因,该酶的发现为手性醇的高效制备奠定了坚实的研究基础。     

(R)-、(S)-羰基还原酶在酿酒酵母中的表达和亚细胞定位

【目的】将增强型荧光蛋白标记的(R)-和(S)-羰基还原酶于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A)细胞中表达,分析荧光蛋白表达谱,确定两种酶在细胞中的功能分布和亚细胞定位。【方法】采用SOE-PCR法克隆出增强型荧光蛋白与(R)-和(S)-羰基还原酶的融合基因,构建到真核表达载体pYX212中,电击转化酵母细胞,以荧光蛋白为筛选标志,观察两种酶在酵母细胞中的表达和分布。【结果】激光扫描共聚焦显微观察表明(R)-和(S)-羰基还原酶多定位于细胞内膜和细胞质中稳定表达,少数成点状分布于细胞中央。根据荧光强度可知(S)-羰基还原酶的表达水平明显高于(R)-羰基还原酶。生物转化结果显示融合型(R)-和(S)-羰基还原酶催化底物2-羟基苯乙酮,分别获得(R)-和(S)-苯基乙二醇,前者产物的光学纯度和产率为86.6%和70.4%,后者产物的光学纯度和产率分别为92.3%和81.8%。【讨论】荧光蛋白与酶的融合没有改变靶蛋白的分子构象与生物活性,酿酒酵母工程菌较重组大肠杆菌具有更明显的生物功能优势,该研究为羰基还原酶蛋白的功能表达调控与亚细胞定位的可视化研究奠定了坚实的基础。     

定点突变改变近平滑假丝酵母SCRⅡ催化苯乙酮衍生物底物谱

【目的】通过定点突变技术,改变近平滑假丝酵母短链羰基还原酶Ⅱ(SCRⅡ)催化苯乙酮衍生物的功能,为数种手性芳香醇的生产提供一种高效、安全的新型制备方法。【方法】通过氨基酸序列和蛋白结构比对的方法,选择SCRⅡ的底物结合域中关键氨基酸位点E228实施突变,构建相应的突变株Escherichia coliBL21/pET28a-E228S;以苯乙酮衍生物为底物,对突变株的酶活和生物转化功能进行了分析。【结果】酶活测定结果表明:突变株E.coli BL21/pET28a-E228S催化原始底物2-羟基苯乙酮的酶活仅为原始酶活的25%左右;而催化苯乙酮、4’-甲基苯乙酮、4’-氯苯乙酮的酶活是突变前的7-20倍。突变株E.coli BL21/pET28a-E228S生物转化2-羟基苯乙酮,获得产物(S)-苯基乙二醇的得率不超过10%,而以苯乙酮、4’-甲基苯乙酮、4’-氯苯乙酮为底物时,生物转化产物光学纯度维持在99%,得率高达80%以上。【结论】对底物结合域中的关键氨基酸实施突变,提高了SCRⅡ催化苯乙酮衍生物的底物广谱性,拓展了该酶的生物功能,为理性改造短链羰基还原酶的不对称还原催化功能和手性芳香醇的制备提供了新型途径。     

苯乙酮转化为(S)-a-苯乙醇的工程菌构建

【背景】(S)-a-苯乙醇是一种重要的药物合成中间体,利用工程菌将苯乙酮转化为(S)-a-苯乙醇的方法具有立体选择性强、转化条件温和等优势,该研究对未来绿色工业化生产有重要意义。【目的】构建能将苯乙酮转化为(S)-a-苯乙醇的工程菌并对其转化条件进行研究。【方法】分别从红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)和博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)中克隆得到羰基还原酶基因ReADH以及甲酸脱氢酶基因FDH,构建pRSFDuet-ReADH-FDH(R1F2)和pRSFDuet-FDH-ReADH (F1R2)两个共表达载体,分别在大肠杆菌中表达。测定R1F2和F1R2中ReADH和FDH酶活性及其催化反应的最适反应条件。对利用全细胞转化苯乙酮为(S)-a-苯乙醇反应条件进行研究。【结果】构建了R1F2和F1R2两个共表达载体,其中R1F2中ReADH和FDH的酶活性分别为6.7 U/mL和7.6 U/mL,对苯乙酮有更强的催化还原能力。R1F2中ReADH和FDH的最适pH分别为6.0和8.5,最适温度分别为40°C和35°C。R1F2全细胞转化苯乙酮反应的最适pH和温度分别为7.5和30°C,对高底物有较强耐受性,对400 mmol/L苯乙酮转化率大于98%,产物(S)-α-苯乙醇的光学纯度大于99%。【结论】研究获得的工程菌及其全细胞转化条件为工业应用奠定了基础。     

（R）与（S）-羰基还原酶偶联一步法制备（S）-苯乙二醇

【目的】通过 (R) - 和(S) -羰基还原酶在大肠杆菌中偶联,实现了一步法制备（S）-苯乙二醇的生物转化过程。【方法】将来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(R)- 羰基还原酶基因（rcr）和(S) -羰基还原酶基因（scr）串联于共表达载体pETDuetTM-1上。重组质粒pETDuet-rcr-scr转化稀有密码子优化型菌株Escherichia coli Rosetta,获得酶偶联重组菌株E. coli Rosetta / pETDuet-rcr-scr。当重组菌体培养至OD600 0.6-0.8时,添加终浓度1 mmol/L IPTG,30℃诱导蛋白表达10 h。【结果】SDS-PAGE结果表明(R)- 和(S) -羰基还原酶均明显表达,它们的相对分子质量分别为37 kDa和30 kDa。重组菌生物转化结果表明：在pH7.0的磷酸缓冲液中,添加5 mmol/L Zn2+时,获得产物(S)-苯乙二醇,产物光学纯度为91.3% e.e.,产率为75.9%。【讨论】采用分子重组技术成功整合了两种氧化还原酶的催化功能,实现了(S)- 苯乙二醇的一步法转化,为简化手性醇制备途径提供了一条崭新的思路。     

高选择性不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺的重组氧化还原酶催化性质及其酶促转化

【目的】通过表达多种重组立体选择性氧化还原酶,分析其催化不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP)的性质,从而构建酶促合成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DHTP)的反应体系。【方法】基于已有立体选择性氧化还原酶重组大肠杆菌,通过Ni离子亲和层析法纯化得到重组氧化还原酶,以DKTP为底物,考察不同重组氧化还原酶对DKTP的催化活性和选择性,进一步对高选择性酶促合成(S)-DHTP的重组酶CR2进行性质分析,并考察其在最适条件下不对称还原DKTP的过程。【结果】筛选获得产物构型为(S)-型的催化活性最高的酶为CR2,该酶米氏常数Km为0.135 mmol/L,kcat/Km为3.689 L/(mmol·s),最适p H 8.4(0.1 mol/L三乙醇胺缓冲液),最适反应温度为35°C,在10-45°C条件下和p H 7.5-8.5较为稳定,Zn2+离子对酶活有促进作用。CR2催化DKTP不对称还原反应6 h后,DHTP的产率达92.1%、光学纯度达99.9%。【结论】基于活性和选择性分析,获得不对称还原DKTP的目标酶CR2,其催化特性有利于高立体选择性还原DKTP生成度洛西汀中间体(S)-DHTP,从而为进一步提高酶促不对称还原DKTP的转化效率提供研究基础。     

近平滑假丝酵母(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中的外泌表达及高效转化(R)-苯基乙二醇

克隆了近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)(R)-羰基还原酶基因rcr,构建胞外表达工程茵Escherichia coli BL21(DE3)/pET20b-rcr,实现了(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中高效外泌表达,周质空间和发酵液酶的比活力分别达0.68 U/mg和0.26 U/mg,与大肠杆菌的胞内体系重组酶相比,酶的比活力提高了近两倍。为了更好地促进该重组酶的外分泌于大肠杆菌细胞外,通过添加温和型化学渗透剂甘氨酸,改善细胞壁的透性,(R)-羰基还原酶的活力提高至1.99 U,与添加甘氨酸前相比,酶活力提高了12.4倍,比活提高了4.3倍。浓缩后的发酵液催化2-羟基苯乙酮,产生(R)-苯基乙二醇,产率为88.1%,e.e.值为93.9%。与胞内重组酶相比,产率和光学纯度分别提高了44.4%和15.9%。本研究通过构建(R)-羰基还原酶的大肠杆菌分泌表达体系,大幅度提高了(R)-羰基还原酶的比活和生物转化手性醇的效率。     

(R)-专一性羰基还原酶与甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达

【目的】通过研究(R)-专一性羰基还原酶和甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达,解决较高底物浓度下不对称转化反应的辅酶限制性问题。【方法】分别以近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)基因组为模板,采用PCR方法扩增得到(R)-专一性羰基还原酶基因（rcr）和甲酸脱氢酶基因（fdh）,克隆到共表达载体pETDuetTM-1中进行表达。共表达质粒pETDuet-rcr-fdh转化稀有密码子优化型菌株E. coli Rosetta,获得重组菌E. coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh。【结果】在30℃条件下,经1 mmol/L IPTG诱导表达8 h后,SDS-PAGE结果表明(R)-专一性羰基还原酶和甲酸脱氢酶均有明显的表达,其相对分子质量分别为37 kDa和 40 kDa。以高浓度(6 g/L)2-羟基苯乙酮为底物时,0.1 g重组菌细胞催化产生(R)-苯基乙二醇,产物光学纯度为100% e.e.,产率为85.9%。与无甲酸脱氢酶参与辅酶再生循环的重组菌E. coli Rosetta/pETDuet-rcr相比,产物光学纯度和产率分别提高了1.3和2.7倍。【讨论】该重组菌的构建为基因工程法生物合成(R)-苯基乙二醇的工业应用奠定了基础。     

马克斯克鲁维酵母羰基还原酶基因的克隆与表达

【目的】研究羰基还原酶基因的克隆、表达及其在不对称生物催化中的应用。【方法】对羰基还原酶氨基酸序列进行BLAST推导出核苷酸序列,设计引物,以马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyce marxianus)CGMCC 2.1977全基因组为模板,通过PCR扩增目的片段,与载体pET-28a连接,转化大肠杆菌获得重组菌BL21(DE3)-(pET28a-cMCR)和Rosetta(DE3)-(pET28a-cMCR)。【结果】扩增的序列与已报道的mer序列有100%同源性,全长1 038 bp,共编码345个氨基酸。目的蛋白在Rosetta(DE3)-(pET28a-cMCR)得到了高效表达,大小为42 kD。该酶最适反应温度为40°C,最适反应pH是8,热稳定性与pH稳定性较差。Ca2+对酶活具有明显的激活作用,且浓度为0.5 mmol/L时效果最好。重组菌可还原4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE],光学纯度为100%,转化率为81.0%。重组菌在制备度洛西汀关键中间体(S)-氮,氮-二甲基-3-羟基-(2-噻吩)-l-丙胺[(S)-DHTP]中也得到初步应用。【结论】从菌株马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyce marxianus)CGMCC 2.1977中克隆获得了羰基还原酶基因,在大肠杆菌中成功表达,并可应用于不对称还原。     

伴有辅酶原位再生的胞外酶耦合法制备（R）-苯基乙二醇

经5轮诱变筛选,从近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis CICC1676）中分离得到产NADH依赖型羰基还原酶（Carbonyl reductase,CR）菌株CP-9。所产羰基还原酶（CRCp-9）经两步快速纯化获得纯化倍数为11．5倍,比活力为1．84 U/mg的酶液,其还原反应的最适pH值为6．5,最适温度为40℃。该酶转化β-羟基苯乙酮制备手性化合物（R）-苯基乙二醇,因此是（R）-专一性羰基还原酶。该酶与NADH普适性再生酶-甲酸脱氢酶（For-mate dehydrogenase,FDH）在胞外相耦联,构建伴有辅酶再生与反复利用的CR/FDH双酶催化制备立体醇体系,底物β-羟基苯乙酮转化率达95．4％,产物（R）-苯基乙二醇得率为93％,辅酶的总转化数（Total turn number, TTN）达267,产物e．e．值为98．6％,批次耦合反应生产能力达0．8 g/L/h,较单酶催化有较大提高,与细胞转化法相比也具有较好的生产能力。因此,伴有辅酶再生的胞外酶耦合催化具有潜在的制备手性醇化合物的工业应用价值。     

新型辅酶依赖型立体选择性氧化还原酶性质的初步研究

为了进一步认识立体选择性转化用菌株近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)SYB-1的转化机理及其转化酶系的酶学特性,考察了该菌种来源的粗酶的辅酶依赖型及立体选择性,发现依赖于辅酶NADP ,该酶将(R)-苯基乙二醇氧化为β-羟基苯乙酮;而依赖于辅酶NADH,该酶不对称还原β-羟基苯乙酮为(S)-苯基乙二醇。在研究该粗酶酶学特性后发现该粗酶对5C的伯醇专一性较强;在包括仲醇和二元醇的手性醇中,对于二元醇的专一性较强;而在还原反应中对2-丁酮专一性较强。金属螯合剂及重金属离子会对该粗酶的活力产生抑制作用。该粗酶催化氧化的最适pH为8.0,最适温度为50℃;催化还原的最适pH为6．0,最适温度为40℃。     

固定化细胞拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的研究

【目的】筛选鉴定一株产酯酶用于选择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的菌株,利用该菌株固定化细胞催化拆分外消旋底物。【方法】通过富集培养、罗丹明B平板初筛及复筛培养获得一株选择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的菌株,通过对其形态、生理生化特征及16S r DNA序列分析,确立该菌株系统发育地位。优化了利用硅藻土-戊二醛吸附交联法对该菌体细胞固定化的条件,研究固定化细胞催化性质及操作稳定性。【结果】该菌为革兰氏阴性菌,鉴定其为甲基球状菌属(Methylopila)。固定化体系最优条件:聚乙烯亚胺0.15%(V/V),戊二醛0.2%(V/V),硅藻土6 g/L,菌体质量浓度100 g/L。与游离细胞相比,固定化细胞最适p H由8.0变为8.5,最适温度由35°C变为40°C,p H稳定性和温度稳定性都有所提高。Cu~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)能促进酶活,Zn~(2+)、Fe~(2+)抑制酶活。固定化细胞的有机溶剂耐受性较游离细胞有所提高。动力学分析细胞固定化后Km值变大,底物亲和力降低。利用固定化细胞水解(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯,底物浓度200 g/L,反应20 h,保留构型为S型,得率47.8%,对映体过量值ees为99.4%,重复使用12次后仍保留初始酶活的80%以上。【结论】开发了利用Methylopila sp.cxzy-L013固定化细胞择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的工艺,该工艺具有良好的工业应用前景。     

嗜热脱氮土壤芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的克隆与重组表达及其酶学性质研究

【目的】克隆嗜热脱氮土壤芽孢杆菌中的β-葡萄糖苷酶基因bglB,在E.coli中异源表达,纯化并研究其酶学性质。【方法】利用PCR技术从嗜热脱氮土壤芽孢杆菌的基因组DNA中克隆得到bglB基因,将该基因克隆到表达载体pGEX-2TL上并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对纯化后的β-葡萄糖苷酶的酶学性质及寡聚状态进行分析。【结果】重组表达的β-葡萄糖苷酶最适温度为65°C,最适pH为7.0,能在pH 5-10、60°C下稳定存在4 h,并能在较高的离子强度(880 mmol/L K+)下发挥其功能。Al3+离子对其有强烈的激活作用,Co2+有一定的抑制作用。最适反应条件下该酶比活力为0.043 IU/mg。该酶具有多种寡聚体形式,这些寡聚体均有β-葡萄糖苷酶活性。【结论】获得一个耐热耐盐的中性β-葡萄糖苷酶,为进一步研究β-葡萄糖苷酶的催化作用机理,提高其热稳定性提供一定的帮助。     

亲和标签调节的 (S)-羰基还原酶2催化2-羟基苯乙酮的酶学性质

不同类型的亲和标签会影响酶的催化功能和酶学性质。近平滑假丝酵母Candida parapsilosis来源的(S)-羰基还原酶2 ((S)-carbonyl reductase 2,SCR2) 能催化2-羟基苯乙酮。文中在SCR2的N端添加不同类型的亲和标签,在大肠杆菌Escherichia coli中异源表达并纯化重组蛋白his6-SCR2、strep-SCR2和MBP-SCR2,研究了重组蛋白催化2-羟基苯乙酮的酶学性质。结果表明,不同类型的亲和标签对SCR2的酶学性质有一定的影响。其中,不同类型的亲和标签对重组蛋白稳定性影响较大：1) 在pH 6.0、30 ℃条件下保温13 h后,重组蛋白his6-SCR2和strep-SCR2的剩余酶活力是无融合标签SCR2的90.0%?95.2%,而MBP-SCR2的剩余酶活力是无融合标签SCR2的1.25倍。2) MBP-SCR2在50 ℃的半衰期比strep-SCR2、his6-SCR2和无融合标签SCR2长26.6%–48.8%。3) MBP-SCR2在?80 ℃存储60 d后,其酶活动力学参数kcat比his6-SCR2、strep-SCR2和无融合标签SCR2高1.25–1.45倍。根据三级结构分析推出重组蛋白MBP-SCR2中MBP的C末端的α螺旋具有稳定SCR2的N端无规则卷曲的作用,从而提高酶的稳定性。圆二色谱检测结果表明MBP标签对蛋白SCR2的二级结构有一定的影响,且解折叠温度 (Tm) 分析证明,MBP-SCR2的Tm比无融合标签SCR2提高近5 ℃。研究结果不仅为羰基还原酶家族增添了一种2-羟基苯乙酮的稳定高效催化剂MBP-SCR2,同时为其他短链醇脱氢酶的标签设计提供了借鉴和依据。     

沙质微泡菌β-1,3(4)-葡聚糖酶的克隆表达及酶学性质

【背景】β-葡聚糖是自然界中广泛存在的非淀粉多糖,是谷类植物细胞壁的主要成分。β-葡聚糖酶能够水解β-葡聚糖生成低聚合度的寡糖,在食品、饲料、造纸等领域发挥着重要的作用。【目的】从海洋细菌沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)中克隆到一个β-1,3(4)-葡聚糖酶基因,在大肠杆菌中可溶表达,研究其相关酶学性质。【方法】以沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)基因组DNA为模板,克隆一个β-1,3(4)-葡聚糖酶基因(MaGlu16A),构建重组表达载体p ET-28a-MaGlu16A并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化后进行酶学性质研究。【结果】MaGlu16A的最适pH和最适温度分别为pH 6.0和40°C,在pH 5.0-10.5和35°C以下稳定。对EDTA具有较高的抵抗性,在1 mmol/L和10 mmol/L EDTA浓度下仍保持99.3%和82.5%的酶活力。该酶能够有效水解可得然多糖、昆布多糖、大麦葡聚糖、地衣多糖、燕麦葡聚糖和酵母葡聚糖,水解产物主要为葡萄糖、二糖、三糖和四糖。【结论】海洋细菌沙质微泡菌(Microbulbiferarenaceous)来源β-1,3(4)-葡聚糖酶的克隆表达及酶学性质的测定为β-葡聚糖酶的挖掘及β-葡寡糖的制备奠定了基础。     

毕赤酵母表达的嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶N-糖基化修饰的作用与功能

【目的】研究N-糖基化对来源于嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,Bgl3A)的酶学性质影响。【方法】采用定点突变技术构建了3个去N-糖基化的突变体T44A、S228A、S299A,并分别在毕赤酵母GS115中表达纯化。【结果】与野生型Bgl3A相比,突变体S228A分泌蛋白产量极低,仅能微量检测到p NPG活性;突变体T44A和S299A的最适pH和最适温度没有改变,分别为4.0和75°C,但二者的T_m值和70°C下的热稳定性都明显优于野生型。以p NPG为底物时,突变体S299A和T44A的催化效率分别降低了14.5%和70.0%;以纤维二糖为底物时,T44A的催化效率基本不变,而S299A的催化效率提高了1.1倍。【结论】Bgl3A不同位点的N-糖基化修饰对酶的分泌和酶学性质的影响具有明显差异。其中,N226位的N-糖基化在维持酶的表达和功能方面至关重要,而去除N297位点的N-糖基化可以提高酶的热稳定性及对纤维二糖的催化效率。     

乙醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶偶联催化制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇

(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇是抗癌药物克唑替尼的手性合成前体,可由2,6-二氯-3-氟苯乙酮经乙醇脱氢酶催化还原制备,还原中所需的还原型辅酶Ⅱ再生是该反应的技术瓶颈.本研究构建重组大肠杆菌E.coli BL21-ADH和E.coli BL21-GDH,实现了葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的共表达,并进行偶联转化.结果表明,当在反应温度为30℃,pH为7的条件下,(S)-l-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产量达到最高,在投料量为6％时,该体系转化率为93.75％.     

不对称水解(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯新菌种的分离鉴定及酯酶基因的克隆、表达

【目的】筛选鉴定1株可以选择性水解农药甲霜灵的中间体(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯(MAP)的菌株,并克隆、表达该菌株中的酯酶基因。【方法】以MAP为唯一碳源,对活性污泥样品中的微生物进行富集培养,采用罗丹明B平板显色法进行初筛,通过摇瓶复筛得到了1株对MAP具有最高对映体选择性和水解活力的新菌株,根据其形态、生理生化特征及16S rRNA序列分析,确立该菌株的系统发育学地位。构建该菌株的基因文库,筛选获得含目的基因的克隆子,通过序列分析和引物扩增得到酯酶基因,将基因与表达载体pET28a(+)连接后,转化大肠杆菌BL21Gold(DE3)plysS,构建重组菌。【结果】该菌属于革兰氏阴性菌,结合16S rRNA基因、形态特征和生理生化实验结果,鉴定该菌为反硝化无色杆菌。通过基因文库法,找到了该菌中的酯酶基因EHest,并成功构建了重组大肠杆菌EHest-p ET28a(+)-BL21Gold(DE3)plys S,表达了来自Achromobacter denitrificans 1104且具有不对称水解MAP活性的酯酶EHesterase,大小约27 kDa,表达酶活是原始菌株的27.1倍。用EHesterase催化MAP水解,底物浓度50 g/L,反应1 h,底物转化率为29.5%,产物(酸)的ee_p为85.1%,对映体选择性为R型。该酶的最适反应pH和温度分别为pH 9.0和50°C。它水解MAP的活性分别是水解橄榄油和乙酸乙酯活性的333倍和667倍。【结论】筛选到1株具有不对称水解MAP能力的新菌株Achromobacter denitrificans 1104。