利用非洲爪蟾精子染色质和卵提取物在体外重建细胞核

应用非洲爪蟾去膜精子染色质和卵提取物成功地进行了细胞核本外重建。当精子染色质加入卵提取物后,首先发生染色质去浓缩作用,染色质整体结构膨胀;膜泡在膨胀的染色质外周聚集并逐渐彼此融合成双层膜;核孔复合体以某种未知方式组装入双层膜而形成核膜结构,并逐渐完全覆盖膨大的染色质,最终形成典型的间期核结构。     

应用HeLa细胞染色体(簇)和蛙卵提取物进行细胞核体外重建试验

将HeLa细胞中期染色体(簇)、非洲爪蟾卵提取物和ATP再生体系混合温育,能够促使细胞核自发重建。在此非细胞体系中重建的细胞核处于一般细胞核大小范围,具有典型的双层核膜,核孔复合体、染色质、核纤层、核骨架等结构,核重建具有一个明显的过程;发现环形片层通过与核膜融合方式参与核膜和核孔复合体组装。     

应用HeLa细胞染色体（簇）和蛙卵提取物进行细胞核体外重建试验

将ＨｅＬａ细胞中期染色体（簇）、非液爪蟾卵提取物和ＡＴＰ再生体系混合温育,能够促使细胞核自发重建。在此非细胞体系中重建的细胞核处于一般细胞核大小范围,具有典型的双层核膜、核孔复合体、染色质、核纤层、核骨架等结构;核重建具有一个明显的过程;发现环形片层通过与核膜融合方式参与核膜和核孔复合体组装。     

非细胞体系核重建并非必需核小体与染色质的装配

以质粒DNA在爪蟾卵提取物S- 1 5 0中进行核小体构建时形成的超螺旋结构检测核小体的形成 ;利用阳离子交换剂CM -Cellulose定量结合组蛋白H2A和H2B ;并结合小球菌核酸酶分析核小体的形成 ,研究了爪蟾去膜精子在去除H2A ,H2B的S- 1 5 0中的核重建过程 .结果表明CM -Cellulose可有效去除组蛋白并阻止质粒DNA的核小体构建和精子染色质的改建 .但处理后的S- 1 5 0与膜泡组分仍可诱导去膜精子进行体外核重建 ,进一步表明非细胞体系核重建与外源DNA长度无关 ;核小体及染色质的组装对于核重建并非必需 .     

甲藻染色体在非细胞体系核重建过程中核小体的组装

利用纯化的原始真核生物寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii E.）染色体,使之与非洲爪蟾（Xenopus laevis L.）S期卵提取物温育,发现甲藻染色体经历了一系列去凝集、再凝集的形态变化,最后形成类似典型高等真核生物的间期核结构。小球菌核酸酶酶切分析表明,不具备组蛋白和核小体结构的甲藻染色体在非洲爪蟾卵提取物中进行了核小体装配,此过程与DNA序列本身、核膜以及核纤层蛋白（Lamin）是否存在无关,但部分拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）参与了这个过程,说明核小体的组装并非为核重建所必需,决定染色体高级结构的因素并不在DNA本身,而可能是非细胞体系中的组蛋白和非组蛋白。     

应用大肠杆菌染色体DNA在非洲爪蟾卵提取物实现诱导非细胞体系核装配

近年来我们实验室已成功地利用细胞核体外组装的实验模式,将多种生物的DNA在非洲爪蟾卵提取物中实现了非细胞体系核装配。但亲缘关系最远的原核生物的染色体DNA是否也能在此真核体系中进行核装配一直没有报道。我们以大肠杆菌染色体DNA为材料,研究了它诱导的非细胞体系核装配。在光镜与电镜水平观察了核装配的过程。显微分光光度计扫描显示DNA片段在核装配过程中经历了凝集-去凝集的变化。证明大肠杆菌染色体DNA也能诱导爪蟾卵提取物装配成具有典型结构的核。α-~(32)P-dCTP的掺入实验表明重建核具有较高的DNA复制活性。     

非细胞体系核重建过程中两类膜泡在环形片层及核被膜形成中的作用

非洲爪蟾卵经钙离子载体Ａ２３１８７激活后,在１０,０００ｇ下离心得到爪蟾卵提取物,ＬａｍｂｄａＤＮＡ中入上述提取物可构建出染色质结构,并在染色质表面重建核被膜,同时,在染色质外的区域形成环形片层。核被膜在环形片层有相似的发生途径,它们都是由两类在形态、大小、膜结构上有明显差别的膜泡融合而来,首先是直径２００ｎｍ的圆形小膜泡相互融合成双层膜片层,同时核孔复合体在双层膜上大量装配;以这些双层膜片层为基     

非细胞体系核重建过程中两类膜泡在环形片层及核被膜形成中的作用

非洲爪蟾卵经钙离子载体A 23187激活后,在10,000g下离心得到爪蟾卵提取物。Lambda DNA加入上述提取物可构建出染色质结构,并在染色质表面重建核被膜,同时在染色质外的区域形成环形片层。核被膜与环形片层有相似的发生途径,它们都是由两类在形态、大小、膜结构上有明显差别的膜泡融合而来。首先是直径200nm的圆形小膜泡相互融合成双层膜片层,同时核孔复合体在双层膜上大量装配,以这些双层膜片层为基础,光滑的大膜泡与之融合导致环形片层的扩张与核被膜的成熟。     

用DNA酶切小分子片段在非洲爪蟾卵提取物中实现非细胞体系核装配

用质粒ｐＢＲ３２２的ＤＮＡ酶切片段,长度分别为７５０、３７５和１８６ｂｐ作为外源ＤＮＡ在非洲爪蟾 卵提取物中实现了非细胞体系的核装配（核重建）。将分离纯化得到的 ＰＢＲ３２２ ＤＮＡ酶切后经低熔 点琼脂糖回收ＤＮＡ片段,长度为７５０、３７５和１８６ｂｐ,分别加入到爪蟾卵提取物再生系统中温育, 经ＤＡＰＩ染色、孚尔根染色及电子显微镜观察发现能装配大量的重建核。显微分光光度法研究表 明,ＤＮＡ片段在诱导形成重建核的过程中发生了明显的凝集－会凝集变化。α－３２Ｐ－ｄＣＴＰ掺入重建核 的液闪计数结果表明,ＤＮＡ酶切小分子片段诱导形成的重建核具有较高的ＤＮＡ复制活性,而且复 制活性在一定范围内与加入的ＤＮＡ片段长度呈正相关。实验结果表明,非细胞体系中诱导的核重 建不仅与外源ＤＮＡ的种类无关,与外源ＤＮＡ的长度也没有关系。     

用DNA酶切小分子片段在非洲爪蟾卵中提取物中实现非细胞体系核装配

用质粒ｐＢＲ３２２的ＤＮＡ酶切片段,长度分别为７５０,３７５和１８６ｂｐ作为外源ＤＮＡ在非洲爪蟾卵撮以物中实现了非细胞体系的核装配。将分离纯化得到的ｐＢＲ３２２ＤＮＡ酶切后经低熔点琼脂糖回收ＤＮＡ片段,长度为７５０,３７５和１８６ｂｐ,分别加入到爪蟾卵提取物再生系统中温育,经ＤＡＰＩ染色,孚尔根染色及电子显微镜观察发现能装配量的重建核。     

体外细胞核组装中核纤层与核膜的关系

采用非洲爪蟾卵提取物非细胞体系,以外源Lambda DNA诱导细胞核的体外组装,以此实验模式为基础,研究了细胞核体外组装过程中核纤层的组装,结果表明核纤层蛋白参与细胞核的体外组装过程,核内骨架的组装与核纤层的组装在时间上是有序的,核内骨架的组装可能为核纤层的装配提供了先决条件.在非洲爪蟾卵提取物非细胞体系中加入抗核纤层蛋白抗体,抑制核纤层的正常装配过程,核膜组装发生异常.结果提示核纤层的组装与核膜的组装是密切相关的.     

四膜虫(Tetrahymena shanghaiensis)大核核仁与去膜大核能诱导非细胞体系核重建

外源DNA或染色质在非洲爪蟾卵提取物中可以诱导细胞核样结构的重建。重建核除不具有核仁样结构外,在其它形态结构上与真核细胞核十分相似。前人的工作表明在重建核中具有核仁前体结构。但可能是由于缺少活性核仁组织者的缘故,这些核仁前体不能相互融合形成新生核仁。那么活性核仁组织者在重建核中是否能发挥其功能呢?为了研究这一问题,我们提取纯化了四膜虫的大核与大核的周边核仁。进一步去除大核的核被膜,并将去除核被膜的大核与大核核仁分别加入非洲爪赡卵非细胞体系中。通过电镜超薄切片观察,我们发现无论是与大核染色质相连的周边核仁还是分离纯化的核仁结构在非洲爪赡卵非细胞体系中都不能保持其原有结构特征,而是发生了典型核重建变化,并且在诱导形成的重建核中也看不到核仁样结构。这些结果说明具有活性的核仁组织者在加入非洲爪蟾卵提取物后既不能继续保持其原有的RNA转录功能也不能诱导新的核仁的出现。     

应用大肠杆菌染色素DNA在非洲爪蟾卵提取物实现诱导非细胞体系…

近年来我们实验室已成功地利用细胞核体外组装的实验模式,将多种生物的ＤＮＡ在非洲爪蟾卵提取物中实现了非细胞体系核装配。但亲缘关系最远的原核生物的染色体ＤＮＡ是否也能在此真核体系中进行核装配一直没有报道。我们以大肠杆菌染色体ＤＮＡ为材料,研究了它诱导的非细胞体系核装置。在光镜与电镜水平观察了核装配的过程。显微分光光度计扫描显示ＤＮＡ片段在核装配过程中经历了凝集－去凝集的变化。证明大肠杆菌染色体ＤＮＡ也     

拟异蚖和古蚖精子的超微形态和精子形成的研究(原尾目:古蚖科)

余山拟异蚖和3种古蚖的精子均为扁圆形,未见顶体,线粒体集中在一侧;核呈环形、边位、中部由膜状体分布其间.领结古蚖的早期精细胞为球形,染色质凝集成团,继而核中裂并沿细胞赤道逐渐围绕成环,染色质呈细沙状,胞间有“桥”相通.核膜一端开始内陷,出现黑点.待发育到中期精细胞,这些黑点逐渐形成奇特的管状核膜陷体;染色质变成短线形,随后排成4—5行.线粒体颗粒状,细胞间仍有“桥”连通.晚期精细胞的染色质凝集成粗带,最后形成光滑质密的核,而多余的核物质,一段一段从精子一端脱离,形成一串孢囊状体夹在精子之间,待精子成熟游离时,这些孢状体分散开来.从观察结果表明拟异蚖精子与古蚖的非常相近.     

四膜虫（Tetrahymena shanghaiensis）大核核仁与去膜大核能诱导非…

外源ＤＮＡ或染色质在非洲爪蟾卵提取物中可以诱导细胞核样结构的重建。重建核除不具有核仁样结构外，在其它形态结构上与真核细胞核十分相似。前人的工作 重建中具有核仁前体结构。但可以是由于缺洗涤戌一核仁组织者的缘故，这些核仁前体不能相互融合形成新生核仁。那么活性核仁组织 重建核中是否能发挥其功能呢？为了研究这一问题，我们提取纯化了四膜虫的大核与大核的周边核仁。进一步去除大核与大核核仁分别加入非洲爪蟾卵非细     

大肠杆菌galK基因与gPt基因在爪蟾卵母细胞中的表达

把含有E．Coil gal K基因和gpt基因的几种重组质粒显微注射到爪蟾(Xencpus Laevis)卵母细胞的核中,用淀粉凝胶电泳检测到了细菌基因的表达产物。E．Coli gal K基因和gpt基因在爪瞻卵母细胞中的表达依赖于SV40病毒早期启动子的存在,而小鼠β-珠蛋白启动子在爪蟾卵母细胞中缺乏活性。此外,增强子在爪蟾卵母细胞中对细菌基因的活性有较为明显的增强作用。     

非洲狼尾草珠心细胞程序死亡过程的超微结构观察

用透射电子显微镜观察了非洲狼尾草珠心细胞衰亡过程,比较明显的结果是,染色质凝集,核周腔膨大呈袋状,内有包裹着核物质的内膜突起;有些内质网槽库膨大成囊泡,能吞噬细胞质;线粒体结构简化,内嵴消失.     

角蛋白纤维的新功能--在爪蟾卵提取物核膜重组装中的作用

激活的非洲爪蟾卵提取物温育过程中,直径２００ｎｍ的膜泡附着在一种直径１０ｎｍ纤维上,形成“珠链”结构。用透射电镜整装制样技术观察了温育中“珠链”结构的形成过程,发现１０ｎｍ纤维可抗Ｔｒｉｔｏｎ抽提,免疫荧光和蛋白免疫印迹试验表明１０ｎｍ纤维可能是由５６ｋＤ的碱性角蛋白与４２ｋＤ的酸性角蛋白构成。向提取物中加入碱性角蛋白抗体ＡＥ３则可抑制环状片层的形成,而核膜的组装也受到很大影响。这些结果显示角蛋白     

利用腺病毒DNA与爪蟾卵提取物在非细胞体系中重构细胞核(简报)

1983年,Lohka和Masui首先报道,用精子染色质与卵提取物一起温育,可以组装成具有典型结构的细胞核。这种核不仅具有合成DNA的能力,而且还能进入M期。同年,     

爪蟾卵无细胞系统中核的自组装和组装核染色质纤维的研究

以人工促排的非洲爪蟾卵为材料制备体外无细胞系统,加入Lambda DNA或染色质,用荧光显微镜和电子显微镜观察核的自组装现象.在核的自组装过程中可以看出由丝状、不规则块状到小球状的形态变化,直至形成与真核细胞间期核的形态、结构相似的组装核.在加入染色质时,所观察到的现象和加入Lambda DNA时相似,但形成组装核的过程较快.组装核经过适当浓缩后,以低渗铺展法使其破裂,从核中释放的染色质纤维,电镜观察与细胞核内的染色质有相似之处也有其本身的特点.用蛋白酶处理,纤维变得光滑,其上的颗粒消失;DNase的作用则可使纤维消失,只剩下一些颗粒和片段;RNase处理时没见变化.