黑曲霉C112纤维二糖酶基因的克隆与生物信息学分析

以紫外诱变获得的高产纤维素酶黑曲霉C112菌株为模板,采用RT-PCR技术克隆黑曲霉C112的纤维二糖酶基因bgl(Gen Bank登录号:KP307454);该基因全长2 934 bp,含有非编码序列,编码860个氨基酸,等电点为4.70,核酸序列与数据库的Aspergillus niger(Gen Bank登录号JX982101.1)同源性达到了99%;生物信息学分析表明,纤维二糖酶为具有一定亲水性的稳定酸性分泌蛋白;二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为结构元件;该基因经IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测结果表明,重组表达产物的相对分子量约为93.3 k D,与预期相符;纤维二糖酶在大肠杆菌BL21中胞内融合表达,重组蛋白p NPG酶活为5.847U/m L,最适反应温度为50℃,最适p H值为5.0。     

嗜盐古菌Haloferax volcanii WFD11中龙胆酸1,2-双加氧酶HagA的研究

【目的】研究嗜盐古菌Haloferax volcanii WFD11菌株以不同芳香酸作为碳源的生长情况;鉴定其通过龙胆酸途径代谢芳香酸过程中的开环酶龙胆酸1,2-双加氧酶的基因,并对其进行生化水平的研究;初步揭示古菌和细菌代谢芳香酸的可能差异。【方法】分别以4 mmol/L的6种不同芳香酸为唯一碳源培养菌株WFD11,利用全自动生长曲线分析仪测定菌株生长情况并绘制生长曲线;利用高效液相色谱检测菌株WFD11代谢3-羟基苯甲酸的中间产物;对菌株WFD11的基因组进行生物信息学分析,寻找潜在的龙胆酸1,2-双加氧酶编码基因,并在Haloferax volcanii H1424中异源表达;通过快速纯化系统(采用Ni2+-NTA亲和层析柱)纯化异源表达的蛋白,以龙胆酸为底物通过紫外分光光度计检测粗酶液和纯化后的龙胆酸1,2-双加氧酶和相关酶学特性;通过实时定量PCR观察hag A的表达类型。【结果】菌株WFD11能以4 mmol/L的3-羟基苯甲酸和3-羟基苯丙酸为唯一碳源和能源生长;高效液相色谱检测证明菌株WFD11通过龙胆酸代谢3-羟基苯甲酸(3HBA);克隆和异源表达了龙胆酸1,2-双加氧酶基因hag A;Hag A粗酶液和纯化蛋白均具龙胆酸1,2-双加氧酶的活性,催化龙胆酸开环生成顺丁二酸单酰丙酮酸;Hag A的龙胆酸1,2-双加氧酶比活力为0.024 8 U/mg,且其活性不依赖于Fe2+;荧光定量PCR实验结果证明hag A是组成型表达。【结论】嗜盐古菌H.volcanii WFD11可能是通过龙胆酸途径代谢芳香酸类物质,为进一步研究古菌和细菌代谢芳香酸的可能差异打下了基础。     

4-羟基苯乙酸-3-羟化酶A重组表达菌株的构建及其对羟基酪醇的生物转化研究

目的:构建表达4-羟基苯乙酸-3-羟化酶A(4-hydroxyphenylacetate-3-hydroxylase A,HHA)的重组菌株,进而以酪醇为底物,利用重组菌株转化生产羟基酪醇。方法:选择大肠杆菌BL21(DE3)为模板来扩增HHA基因,经酶切后连接到表达载体p ET-28a中,获得重组表达载体p ET28a-HHA,将重组载体转化到感受态细胞BL21(DE3),在重组菌液中加入适量酪醇,利用胞内的重组酶对酪醇加羟基合成羟基酪醇,细胞离心后,分别采用薄层层析法和气质联用法检测上清液中羟基酪醇的转化结果。结果:IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE分析获得分子质量分别为58.8k Da和18.5k Da的两条蛋白质条带。薄层层析法和气质联用法均检测到催化产物羟基酪醇的生成。结论:成功构建了表达HHA的重组菌株,该菌株可有效将酪醇转化为羟基酪醇。     

一株细菌儿茶酚型铁载体分泌的影响因素研究*

采用两种新的高分辨率的薄层层析(TLC)方法对一株土壤细菌S1在3种不同培养基上产生的儿茶酚型铁载体进行了分析。结果表明:不同培养基对铁载体的产生影响较大,在3种不同的培养基上菌株S1产生不同的儿茶酚铁载体,其中仅在1种培养基上S1能够分泌2,3-二羟基苯甲酸(2,3-DHBA)。同时,还分析了A l³⁺对S1分泌的儿茶酚型铁载体总量的影响,结果表明:Al³⁺能显著刺激铁载体的分泌,并且能抵消一定浓度范围内的Fe²⁺对铁载体分泌的抑制作用,     

伯克霍尔德氏菌ZYB002脂肪酶lipC24基因的克隆、表达及其酶学性质

【目的】克隆伯克霍尔德菌ZYB002菌株中的新型脂肪酶lip C24基因,测定其基本酶学性质,为后续深入研究该基因在菌株中的生理功能奠定基础。【方法】根据洋葱伯克霍尔德菌JK321菌株的全基因组DNA信息,直接设计引物从伯克霍尔德菌ZYB002菌株基因组中扩增出lip C24基因,并对之进行原核表达、重组蛋白的纯化及酶学性质分析。【结果】lip C24基因全长1317 bp,编码438个氨基酸残基;多肽链中具有保守五肽-G-X1-S-X2-G-序列;重组蛋白Lip C24的分子量为45 k Da;能有效水解各种对硝基苯酯,对中链脂肪酸的对硝基苯酯表现出偏爱性;其催化水解反应的最适温度为40℃,最适p H7.5;40℃下的半衰期为15.72 min,在p H 7.0-8.0的条件下,具有较好的稳定性。【结论】lip C24的编码产物为一个45 k Da蛋白,具有明显的脂肪酶活性,为中温中性脂肪酶。     

根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解代谢中agnE基因的克隆与功能鉴定

【目的】本研究对尼古丁降解菌根癌土壤杆菌SCUEC1菌株中agnE基因进行克隆表达,并对agnE基因表达蛋白进行功能鉴定。【方法】通过PCR扩增获得agn 全长基因(1029 bp),构建重组质粒pET28a-agnE,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行异源表达,采用SDS-PAGE检测重组蛋白。以2,5-二羟基吡啶作为反应底物,在检测波长320 nm下测定反应液吸光度值,进一步研究温度、pH值和金属离子对AgnE蛋白酶活性的影响。【结果】克隆得到基因agnE,构建了p ET28a-agnE重组质粒并进行了表达,AgnE蛋白分子量为42.0 kDa,表达蛋白以包涵体形式存在于细胞中。酶促反应0、5、10、20 min时反应液吸光度分别为0.6170、0.2273、0.0907、0.0667。在pH 8.0、温度20°C下,AgnE蛋白具有较高的2,5-二羟基吡啶双加氧酶活性,且Fe2+对酶活性具有明显的促进作用。【结论】明确了Agn E蛋白具有2,5-二羟基吡啶双加氧酶活性。     

基于生物信息学分析从Streptomyces albofaciens JCM 4342中发现2,3-二羟基苯甲酸酯-L-丝氨酸脱水三聚体和二聚体天然产物（英文）

【背景】铁是细菌生长的基本元素,而三价铁在自然水环境中几乎无法溶解。细菌已经进化出产生各种铁载体的能力,以促进铁的吸收。对于链霉菌,其特有的铁载体是去铁胺,同时它们也可以产生其他结构的铁载体,如Ceolichelin、白霉素、肠杆菌素(Enterobactin)和Griseobactin。【目的】揭示链霉菌中铁载体生物合成基因簇(Biosynthetic Gene Clusters,BGCs)的分布特点和基因簇特征,并探索其所合成铁载体的化合物结构。【方法】利用生物信息学工具系统地分析308个具有全基因组序列信息的链霉菌中的铁载体生物合成基因簇,并用色谱和波谱方法分离和表征肠杆菌素相关天然产物。【结果】发现Streptomyces albofaciens JCM 4342和其他少数菌株同时含有一个缺少2,3-二羟基苯甲酸(2,3-DHB)生物合成基因的孤立的肠杆菌素生物合成基因簇和另外一个推测可合成Griseobactin的基因簇。从S. albofaciens JCM 4342发酵液中鉴定出4个肠杆菌素衍生的天然产物,包括链状2,3-二羟基苯甲酸酯-L-丝氨酸(2,3-DHBS)的三聚体和二聚体以及它们的脱水产物。【结论】2个基因簇间存在一种特别的协同生物合成机制。推测是Griseobactin基因簇负责合成2,3-DHB,而孤立的肠杆菌素基因簇编码的生物合成酶可夺取该底物,进而完成上述4种肠杆菌素衍生天然产物的生物合成。     

一株对羟基苯甲酸酯海洋降解菌的关键酶基因克隆与表达

【背景】对羟基苯甲酸及其酯类常作为合成多种芳香族化合物的前体物质广泛应用于多个领域,但其难以自然降解给环境造成了污染问题,同时这些污染物随着洋流迁移到海洋中破坏海洋生态环境。【目的】从海洋环境中筛选对羟基苯甲酸酯高效降解菌,通过全基因组测序及注释分析,预测对羟基苯甲酸酯代谢通路,确定其代谢过程中的关键酶并进行功能研究。【方法】通过富集培养从海洋环境中分离对羟基苯甲酸酯降解菌,利用基因克隆技术将降解对羟基苯甲酸酯关键酶基因在大肠杆菌中高效表达,探究重组蛋白活性及酶学特征。【结果】从海底泥沙中筛选到一个菌株,经16S rRNA基因测序鉴定为硝化柠檬球菌(Citricoccus nitrophenolicus);该菌株能够利用多种对羟基苯甲酸酯类物质进行生长,在甲酯为碳源条件下生长状态最好;将羧酸酯酶基因和单加氧酶基因在大肠杆菌中进行高效表达,重组表达的羧酸酯酶最适反应条件为：pH 8.0,30℃反应30 min;重组表达的单加氧酶活性表达依赖于辅酶,Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺和Fe3+可增强该酶活性;经荧光定量PCR进一步...     

PCR结合酶切-序列比对法鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株

目的用PCR结合酶切-序列比对法对B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行鉴定。方法用玻片凝集法对不同来源的15株B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行初步检定,再用PCR结合酶切-序列比对法对上述15株菌株进行进一步鉴定,即用PCR结合酶切法扩增菌株的唾液酸转移酶sia D基因并对PCR产物进行酶切后,用BLAST软件将PCR产物测序结果与Gene Bank中原始sia D序列比对。结果 15株菌株玻片凝集结果均为阳性;15株菌株的PCR产物片段大小均为460 bp;TaqⅠ酶切后,13株菌株的酶切产物片段大小仍为460 bp,其PCR产物测序比对结果与B群脑膜炎奈瑟菌原始sia D序列同源性均达到99%;其余2株酶切产物片段大小约200 bp,与C群脑膜炎奈瑟菌sia D原始基因序列同源性分别为98%和99%。结论 15株菌株经PCR结合酶切-序列比对法鉴定,13株为B群脑膜炎奈瑟菌菌株,2株为C群脑膜炎奈瑟菌菌株;该方法可准确鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株。     

一株细菌儿茶酚型铁载体分泌的影响因素研究

采用两种新的高分辨率的薄层层析（TLC）方法对一株土壤细菌S1在3种不同培养基上产生的儿茶酚型铁载体进行了分析。结果表明：不同培养基对铁载体的产生影响较大,在3种不同的培养基上菌株S1产生不同的儿茶酚铁载体,其中仅在1种培养基上S1能够分泌2,3-二羟基苯甲酸（2,3-DHBA）。同时,还分析了Al^3＋对S1分泌的儿茶酚型铁载体总量的影响,结果表明：Al^3＋能显著刺激铁载体的分泌,并且能抵消一定浓度范围内的Fe^2＋对铁载体分泌的抑制作用,KMB培养液中产生的4种儿茶酚铁载体中有3种和Al^3＋有较强的螯合力．     

洋葱伯克霍尔德氏菌L68双加氧酶区基因克隆及序列分析

克隆洋葱伯克霍尔德氏菌L68双加氧酶区基因并对其进行序列分析。采用邻苯二酚喷洒方法从洋葱伯克霍尔德氏菌L68的基因文库中筛选到了1株含有双加氧酶区基因的重组子,其重组质粒命名为pB2k。重组质粒pB2k含有8030bp的L68基因片断,经BLAST比对,该片断含有11个与已报道的ORF相近的ORF。在该片断的5’端,ORF1和ORF2分别编码两个转移酶基因,tomA1t、omA2t、omA3和tomA4编码酚羟化酶组份,tomA5编码氧化还原酶,phnT编码铁氧还蛋白,phnE编码邻苯二酚2,3-双加氧酶,ORF3编码未知功能蛋白,phnG编码部分2-羟粘糠酸半醛脱氢酶。     

油橄榄HMGR基因家族的克隆表达及功能验证

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR),催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-Co A)生成甲羟戊酸(MVA),是MVA途径中第一个关键酶。油橄榄是一种重要的经济油料作物,其含有的萜类物质具有重要营养价值,但关于调控萜类物质代谢途径的关键基因研究较少。为研究萜类合成途径关键酶基因HMGR,本研究采用RT-PCR法克隆油橄榄HMGR基因,进行生物信息学分析及构建原核表达载体,对表达蛋白生物活性进行功能验证,并采用荧光定量PCR分析HMGR在油橄榄不同生长阶段的表达量。结果表明:克隆出油橄榄HMGR基因家族的三个基因,分别命名为Oe HMGR1、Oe HMGR2、Oe HMGR3,m RNA ORF的长度分别为1 713 bp、1 773 bp、1 737 bp,编码570、590、578个氨基酸;基因编码蛋白均有2个跨膜区及HMGR催化活性的结构域,不含信号肽;构建了原核表达载体p ET30b(+)-Oe HMGR,转入到大肠杆菌BL21中成功表达,3个重组酶蛋白分子量大小均在66.2~68.0 k D之间,分离纯化重组蛋白进行功能验证,GC-MS检测表明该蛋白具有HMGR催化活性功能;荧光定量PCR分析表明该家族基因在果实和叶片中表达量较高,而在根、茎、花中表达量较低,在开花后45 d、90 d、120 d表达量较低,但在花后165 d表达量上升至较高水平。该研究为进一步鉴定Oe HMGR的功能及油橄榄萜类物质的合成生物学研究奠定基础。     

联苯利用节杆菌YC-RL1中2,3-二羟基联苯-1,2-双加氧酶BphC功能验证

【目的】通过节杆菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1对多氯联苯降解过程中关键基因bph C的克隆与原核表达,鉴定其编码的2,3-二羟基联苯-1,2-双加氧酶Bph C的酶活特性与功能。【方法】以菌株YC-RL1全基因组为模板进行PCR扩增获得bph C基因,将该基因转入Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞后进行原核表达;利用镍柱亲和层析法对Bph C酶进行纯化并分别测定该酶在不同条件下对底物2,3-DHBP的催化特性,确定其最适反应pH、温度及不同金属离子对酶活特性的影响;进一步根据米氏方程对该酶的动力学参数进行测定与分析。【结果】通过PCR扩增获得了bphC基因,其大小为930 bp;对该基因进行原核表达,所得重组蛋白BphC携带有6个组氨酸标签,经纯化后体外仍具有活性,该酶作用于2,3-DHBP时的最适pH与温度分别为pH 7.4和30°C,且在最适条件下,Fe~(2+)、Cu~(2+)及Cd~(2+)等金属离子可明显促进其酶活作用,但多数金属离子对该酶有不同程度的抑制作用;该酶在与底物2,3-DHBP作用过程中,酶促动力学常数分别为K_m:8.67 mmol/L,V_(max):27.32μmol/s,k_(cat):15.55 s~(–1),k_(cat)/K_m:1.79 L/(mmol·s),其催化效率同有关报道中同类酶的动力学特性比较均有所提高。【结论】菌株YC-RL中的bphC基因对于多氯联苯的生物降解具有至关重要的作用,其编码的BphC是重要的芳香环裂解酶,该酶对其底物具有较高的亲和性,可在体外环境中发挥高效的酶促作用,具有良好的应用价值。     

低温几丁质酶基因在乳酸克鲁维酵母中的重组表达及酶学性质表征

【目的】通过构建假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.DL-6)低温几丁质酶(chitinaseA,chi A;chitinase C,chi C)的重组乳酸克鲁维酵母菌株、纯化重组蛋白并对其进行酶学性质表征,为低温几丁质酶潜在工业化生产几丁寡糖奠定理论基础。【方法】人工合成密码子优化的几丁质酶基因,构建重组乳酸克鲁维酵母表达质粒(p KLAC1-chi A、p KLAC1-chi C)并用电脉冲法转化到乳酸克鲁维酵母中,实现低温几丁质酶的可溶表达。利用镍柱亲和层析纯化得到高纯度的重组几丁质酶。【结果】成功构建产低温几丁质酶的重组乳酸克鲁维酵母并纯化获得高纯度的重组几丁质酶。经SDS-PAGE分析在110 k Da与90 k Da附近出现符合预期大小的蛋白条带。铁氰化钾法测得Chi A和Chi C的酶活分别为51.45 U/mg与108.56 U/mg。最适反应温度分别为20°C和30°C,最适p H分别为8.0和9.0。在低于40°C,p H 8.0–12.0时,Chi A和Chi C重组酶较稳定。Chi A和Chi C对胶体几丁质以及粉状底物α-几丁质与β-几丁质具有明显的降解活性,且具有一定协同降解能力。【结论】首次实现假交替单胞菌来源的低温几丁质酶在乳酸克鲁维酵母中的重组表达、纯化、酶学性质及其降解产物分析,为其他低温几丁质酶的研究提供借鉴意义。     

水母雪莲查尔酮合酶基因的克隆、表达及酶活分析

从水母雪莲Saussurea medusa Maxim. cDNA文库中得到一段查尔酮合酶基因 (SmCHS) 片段,然后通过RT-PCR得到完整的查尔酮合酶基因cDNA。序列分析表明SmCHS全长1 313 bp,其开放阅读框为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测表达蛋白的分子量为43 kDa。构建原核表达质粒pET28a(+)-SmCHS,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,表达的融合蛋白以部分可溶的形式存在。用Ni-NTA预装柱对融合蛋白进行亲和纯化,对纯化蛋白进行酶活检测,结果表明融合蛋白具有查尔酮合酶活性,可催化底物4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A缩合生成产物柚皮素查尔酮。     

利用酿酒酵母YPG30验证橡胶树白粉菌OhIsc1蛋白的分泌功能

橡胶树白粉菌(0idium heveae)引起的橡胶树白粉病严重影响天然橡胶产量而造成经济损失.水杨酸(salicylic acid,SA)是植物细胞内一种重要的抗病防卫反应的信号分子.植物病原物在致病过程中会分泌出异分支酸酶(isochorismatase,ISC)水解异分支酸,从而抑制植物中SA的积累并影响植物的抗病性.本研究通过生物信息学方法鉴定到橡胶树白粉菌中存在一个异分支酸酶同源蛋白的编码基因(OhIsc1),长度为693 bp,具有3个内含子,cDNA大小为600 bp,编码199个氨基酸,且该蛋白为预测的非经典型分泌蛋白,具有ISC保守结构域,属于异分支酸酶蛋白家族,但不具有信号肽.利用同源克隆法获得OhIsc 1的cDNA序列,并构建pYES2-0hIsc1载体,将载体转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株YPG30,获得表达OhIsc 1的转化子.通过Western blot免疫印迹方法在转化子的胞外液中检测到OhIsc1-HA,表明OhIsc1可被酵母细胞分泌至胞外.本研究证实OhIsc1为分泌蛋白,为后续深入研究验证OhIsc 1的分泌功能及其在病菌致病过程的角色提供了基础.     

基于生物信息学分析从Streptomyces albofaciens JCM 4342中发现2,3-二羟基苯甲酸酯-L-丝氨酸脱水三聚体和二聚体天然产物

[背景] 铁是细菌生长的基本元素,而三价铁在自然水环境中几乎无法溶解。细菌已经进化出产生各种铁载体的能力,以促进铁的吸收。对于链霉菌,其特有的铁载体是去铁胺,同时它们也可以产生其他结构的铁载体,如ceolichelin、白霉素、肠杆菌素（enterobactin）和griseobactin。[目的] 揭示链霉菌中铁载体生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Clusters,BGCs）的分布特点和基因簇特征,并探索其所合成铁载体的化合物结构。[方法] 利用生物信息学工具系统地分析308个具有全基因组序列信息的链霉菌中的铁载体生物合成基因簇,并用色谱和波谱方法分离和表征肠杆菌素相关天然产物。[结果] 发现Streptomyces albofaciens JCM 4342和其他少数菌株同时含有一个缺少2,3-二羟基苯甲酸（2,3-DHB）生物合成基因的孤立的肠杆菌素生物合成基因簇和另外一个推测可合成griseobactin的基因簇。从S.albofaciens JCM 4342发酵液中鉴定出4个肠杆菌素衍生的天然产物,包括链状2,3-二羟基苯甲酸酯-l-丝氨酸（2,3-DHBS）的三聚体和二聚体以及它们的脱水产物。[结论] 2个基因簇间存在一种特别的协同生物合成机制。推测是griseobactin基因簇负责合成2,3-DHB,而孤立的肠杆菌素基因簇编码的生物合成酶可夺取该底物,进而完成上述4种肠杆菌素衍生天然产物的生物合成。     

3-甾酮-9α-羟基化酶基因在分枝杆菌中的异源表达与9α-羟基雄烯二酮的制备

9α-羟基雄烯二酮(9-OH-AD)是制备甾体类药物的重要中间产物。3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)能够转化雄烯二酮(AD)产生9α-羟基雄烯二酮(9-OH-AD),该酶由Ksh A和Ksh B两个亚基构成。为获得高效积累9-OH-AD的重组菌株,本研究选择耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis mc2155和戈登氏菌Gordonia neofelifaecis NRRL B-59395,对其在胆固醇为唯一碳源条件下表达明显上调的ksh A和ksh B候选基因进行克隆,插入到分枝杆菌表达载体p NIT中,构建共表达质粒,并将它们导入分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3805中,获得重组菌株。利用重组菌株分别对植物甾醇、胆固醇和谷甾醇进行生物转化,分离纯化转化产物,采用光谱学方法鉴定其化学结构,确定该转化产物为9α-羟基雄烯二酮,说明分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3805由积累雄烯二酮变为积累9α-羟基雄烯二酮(9-OH-AD),进而证明导入的候选基因ksh A和ksh B确实为有功能的基因。生物转化实验表明,与胆固醇、谷甾醇相比,植物甾醇作为底物更易于转化;而用来源于耻垢分枝杆菌的ksh A、ksh B构建的重组菌转化率更高,可达90%,具有较高的应用价值。本研究通过对KSH编码基因的异源表达,成功地进行了分枝杆菌生物转化特性的改造,为探索各种甾体药物中间体的工业生产奠定了基础。     

苏云金芽孢杆菌chiA,chiB全基因的克隆、表达及其序列分析

以苏云金芽孢杆菌科默尔亚种15A3菌株基因组DNA为模版,用touchdown PCR方法扩增几丁质酶ChiA和ChiB的全基因序列(GenBank登录号:EF103273和DQ512474)。将PCR产物连接pUCm-T克隆载体,获得重组质粒pUCm-chiA和pUCm-chiB,分别转化E.coliXL-Blue。克隆的几丁质酶基因可以利用本身的启动子异源表达各自的蛋白,不需要几丁质作为诱导物。表达的几丁质酶能够分泌到胞外。证明15A3菌株可组成型表达2种几丁质酶。经核苷酸及氨基酸序列分析证明,chiA基因全长1426bp,含有343bp的上游非编码区和1083bp的ORF,编码360个氨基酸。推测成熟蛋白分子量为36kD,只有一个几丁质酶催化域。chiB基因全长2279bp,含有248bp的上游非编码区和2031bp的ORF,编码676个氨基酸。推测成熟蛋白分子量约为70.6kD,具有三个功能域。核苷酸序列分析显示chiA和chiB的启动子所处的位置及转录起始碱基都不相同,-35区相同,而-10区有两个碱基不同,SD序列也不完全一致。     

C型产气荚膜梭菌β1、β2毒素基因的融合

利用PCR技术 ,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出 β1 和 β2 毒素基因 ,构建了含 β1 - β2 融合基因表达质粒的重组菌株BL2 1(DE3) (pETXB1_2 )。经酶切鉴定和序列测定证实 ,构建的重组质粒pETXB1_2含有 β1 - β2 融合基因 ,且基因序列和阅读框架正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的 β1 - β2 融合蛋白能够被 β1 、β2 毒素抗体识别。免疫实验结果表明 ,用β1 - β2 融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗 1MLD的C型产气荚膜梭菌C5 9_4 4毒素攻击 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。