葡萄病毒B的RT-PCR检测技术研究

旨在建立适合葡萄的葡萄病毒B的RT-PCR检测技术。从感染葡萄病毒B的葡萄皮层中提取总RNA,以其为模板合成cDNA第一链,并利用两对引物分别进行PCR扩增;回收PCR特异扩增产物,与pUCm-T载体连接,并进行转化、重组克隆的筛选、重组质粒的酶切鉴定和序列测定。结果显示,两对引物均能获得与预期片段大小一致长约460 bp和470 bp的扩增产物扩增片段序列与已报道GVB序列(序列号:X75448)的核苷酸同源性均为81%,经反复多次试验证实,利用总RNA为模板合成cDNA并进行PCR扩增检测GVB是准确、可靠的。     

海藻糖合酶产生菌筛选、鉴定及目的基因克隆

目的:为筛选出一株产海藻糖合酶的菌株,并以此菌的全DNA为模板,克隆出产海藻糖合酶的目的基因片段。方法:实验过程中采用了常规筛选菌种、快速提取细菌全基因、显微镜观察菌种、热启动PCR技术、电泳纯化回收基因片段、EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定目的基因片段等方法。结果:在电镜下可观察到有芽孢、杆菌;菌株16S rRNA基因扩增产物共计1490个碱基;PCR方法扩增出阳性克隆大约1700bp的基因片段。结论:通过生理、形态、结构特征分析及16S rRNA基因全序列比较得出结论:筛选到一株短小芽孢杆菌;PCR扩增出阳性克隆片段,全长1722bp,为实验所要的编码海藻糖合酶的基因片段。     

肺炎链球菌自溶素和溶血素基因的PCR法鉴定

肺炎链球菌是一种致病率和致死率很高的病原菌 ,若无丰富临床检测经验从临床标准中分离鉴定此菌较困难 ,本实验以寡核苷酸引物YH1 YH2、YH7 YH8分别扩增肺炎链球菌自溶素和溶血素基因的 35 4bp和 30 7bp的DNA片段 ,通过改变各种反应条件 ,建立了这两种病原因子基因的PCR检测方法。用此方法对 2 0株肺炎链球菌标准菌株及 7株对照菌株进行了鉴定 ;其扩增产物分别经限制性内切酶TthHB81和和AccI进行酶切以确认扩增产物是否正确 ;用酚 氯仿抽提纯化的全细胞DNA对PCR方法的检测灵敏度进行了测定 ;并利用此方法对 2 8份临床标本分离物进行了鉴定。结果　所有 2 0株肺炎链球菌均可分别用引物YH1 YH2、YH7 YH8扩增出 35 4bp和 30 7bp的DNA片段 ,而对照菌株均呈阴性 ;自溶素及溶血素基因的扩增产物分别经限制性内切酶TthHB81和AccI消化后产生的片段和预期的完全一致 ;两对产物均可从 10fg的全细胞DNA中扩增出目的DNA片段。所建立的两套PCR系统对 2 8份临床标本分离物进行鉴定 ,其中PCR阳性的 15份分离物经生化学特性检查被鉴定为肺炎链球菌。本试验所建立的两套PCR检测系统具有特异性强 ,灵敏度高及操作简单等优点 ,均可用于肺炎链球菌的鉴定。     

分子分型技术用于流脑疫情的同源性分析

目的应用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)技术和脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)技术对大连市2014年4月同一工地两起流脑疫情得到的脑膜炎奈瑟氏菌株进行分子分型图谱分析,了解各菌株之间的亲缘关系。方法对病例的脑脊液标本进行脑膜炎奈瑟菌PCR分群,对另一病例和所有密切接触者分离菌株进行多位点序列分型(MLST)试验和脉冲场凝胶电泳(PFGE)鉴定实验。结果疑似病例标本PCR结果为脑膜炎奈瑟氏菌A群阳性,另一病例和所有密切接触者分离到的菌株PFGE图谱基本相同,表明来自同一克隆系。多位点序列分析结果为ST7。结论两起疫情分离到的菌株型别之间具有高度的同源性,该病原菌类型为ST7的A群脑膜炎奈瑟氏菌。     

1例流行性脑脊髓膜炎病例的菌群鉴定及分析

目的对2015年河南省1例流行性脑脊髓膜炎(流脑)病例的菌群进行分子分型鉴定及分析,为河南省流脑预防和控制工作提供科学依据。方法对患者脑脊液和血液标本以及37例密切接触者咽拭子标本进行细菌培养,提取DNA进行PCR及多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)分析。用ELISA检测密切接触者血清标本的脑膜炎奈瑟菌A群和C群抗体水平。结果患者和1例密切接触者分离的菌株经细菌培养及PCR鉴定,分别为C群和B群脑膜炎奈瑟菌。MLST分型显示,患者和密切接触者标本分别为ST4821型和ST5664型,两者均为ST4821克隆群。37例密切接触者脑膜炎奈瑟菌A群和C群抗体阳性率分别为91.89%和21.62%,平均抗体质量浓度分别为6.50μg/m L和1.73μg/m L。结论引起流脑疫情的致病菌为C群ST4821型脑膜炎奈瑟菌,当地C群平均抗体含量偏低,需加强流脑A+C疫苗的接种,有效预防流脑的暴发。     

改良法克隆淋球菌特征核酸片段

目的：采用改良法克隆淋球菌特征核酸片段300bp到pBS.sk中,作为淋球菌检测试剂盒的阳性标本来源。方法：采用PCR扩增淋球菌特征核酸片段300bp,扩增条件：94℃30s,55℃1min,72℃1min,35个循环,另外用SmalI酶切,pBS,sk,与PCR产物采用改良法平端连接：连接温度14℃,72h,连接反应体积15μl,加10u SamlⅠ防止pBS.sk自连,连接完成后取5μl连接液转化200μlCaCl2制备的感受态受体菌JM109,用碱法提取重组子质粒,电泳比较质粒大小,PCR初筛,最后双酶切鉴定。结果：经过电泳比较质粒大小,PCR初筛,最后双酶切鉴定。结果：经过电泳比较质粒大小,PCR初筛,最后双酶切鉴定,得到5个克隆重组子。     

鸡肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛A基因序列测定和分析

根据GenBank中肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛结构基因A(mrkA)GI:149187的序列设计一对引物,以5株鸡致病性肺炎克雷伯菌临床分离株的基因组DNA为模板,PCR分别扩增出了543 bp的Ⅲ型菌毛结构基因(mrkA),经纯化、连接、转化、筛选得到含阳性质粒的菌株,将酶切鉴定正确的阳性质粒菌株进行DNA测序并分析。结果表明所扩增的片段为鸡肺炎克雷伯菌mrkA基因,其开放阅读框架为543 bp,编码181个氨基酸。     

南极深海底泥色盐杆菌属NJS-2 ectABC基因克隆及二氨基丁酸转氨酶ectA基因的表达

从南极深海底泥中分离筛选得到一株中性嗜盐菌Chromhalobacter sp.NJS-2,以该菌株基因组为模板,利用PCR技术扩增出ectABC基因,基因全序列大小为2378bp。OMIGA软件分析该基因序列上含有三个阅读框,大小分别为576bp、1272bp和393bp,预测其分别编码二氨基丁酸乙酰转移酶（EctA）、二氨基丁乙酸转氨酶（EctB）和四氢嘧啶合酶(EctC)。将二氨基丁酸乙酰转移酶ectA基因的PCR扩增产物克隆至表达载体pET-his, 构建重组表达载体pET-his-ectA,并经酶切、PCR鉴定和测序验证,结果表明其目的基因的插入位置、大小和读码框均正确。SDS-PAGE分析,出现大小约21kDa的目的蛋白条带。     

Alpha珠蛋白基因片段表达载体的构建

目的：构建alpha珠蛋白基因片段反义表达载体,抑制重型beta地贫患者alpha珠蛋白基因的过量表达,为重型beta地贫基因治疗打下基础。方法：采用PCR扩增alpha珠蛋白基因片段807bp,反应条件94℃ 30s,68℃ 1min,72℃ 2min,35个循环,然后将所扩增片段用Klenow大片段酶补平PCR产物末端,另外用HindⅢ酶切pLNSX,用Klenow补平后,与补平末段的PCR产物平端连接,转化用CaCl2制备的感受态细胞受体DH5α,用碱法提取所得克隆子质粒,电泳比较质粒大小,再用PCR初筛,最后用双酶切进行鉴定。结果：经过质粒大小比较,PCR初筛,双酶切鉴定,得到6个正向插入重组子。     

HSV-tk基因逆转录病毒重组体的构建与DNA序列分析

目的　构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (HSV1 tk)基因的逆转录病毒重组载体pLXSN TK。方法设计一对寡核苷酸引物 ,用PCR方法从质粒pHSV10 6中特异扩增HSV tk基因片段 ( 1168bp) ,分别用BamHI和Eco RI酶切后 ,定向连接到质粒pLXSN中 ,转化宿主菌TG1,分别用上述内切酶 ,PCR和DNA测序鉴定重组质粒。结果　酶切鉴定所切下的片段和PCR扩增的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。结论　成功构建了HSV tk嵌合重组质粒pLXSN TK。