针对潜伏结核感染的 A39 DNA 疫苗构建及其免疫原性研究

选取结核分枝杆菌潜伏相关抗原Rv2029c、结核分枝杆菌优秀抗原Ag85A和Rv3425,构建针对潜伏感染的结核分枝杆菌DNA疫苗pVAX1／Ag85A-Rv3425-Rv2029c （A39）,并对其免疫原性进行研究。首先用聚合酶链反应（PCR）扩增Ag85A基因,构建重组质粒pVAX1／Ag85A （A）;PCR扩增 Ag85A-Rv3425连接片段,插入pVAX1载体,构建重组质粒pVAX1／Ag85A-Rv3425（A3）;PCR扩增Rv2029c基因,插入A3,构建重组质粒pVAX1／Ag85A-Rv3425-Rv2029c （A39）。将构建成功的重组质粒转入 HEK293T细胞,蛋白免疫印迹法验证质粒在真核细胞中得到表达。在大肠埃希菌BL21中成功表达和纯化去除信号肽的Ag85A、Rv3425和Rv2029c蛋白。用质粒免疫C57BL／6小鼠,共分为5组：PBS、pVAX1、A、A3和A39组,采用电脉冲导入免疫,每2周免疫1次,共3次,用酶联免疫斑点检测（ELISPOT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术等方法检测细胞免疫和体液免疫水平。结果显示,A39免疫小鼠后,能引发强烈的细胞免疫反应﹝γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素2（IL-2）高水平分泌﹞,外周血CD4＋／CD8＋ T细胞比值增加,CD8＋穿孔素＋ T细胞比例增加。结果表明,构建的A39 DNA疫苗能引发强烈的免疫反应,显示出良好的抗结核潜力,可作为结核分枝杆菌新型候选疫苗。     

结核杆菌抗原85A与小鼠白细胞介素21共表达DNA疫苗的构建及其免疫效应研究

目的:利用真核表达质粒pRSC,构建结核杆菌抗原85A(Ag85A)与小鼠白细胞介素21(mIL21)共表达重组体pRSC-mIL21-Ag85A,为研究新型结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。方法:从质粒pcDNA3.1-mIL21中经PCR扩增出mIL21基因,并插入质粒pRSC中构成pRSC-mIL21;再从pIRES-Ag85A质粒中经PCR扩增出Ag85A基因,构建于pRSC-mIL21重组质粒上,成为共表达DNA疫苗pRSC-mIL21-Ag85A。结果:经酶切、基因测序证实,该疫苗构建正确并能成功表达目的基因。共表达DNA疫苗免疫小鼠后,CTL活性、特异性淋巴细胞增殖水平及小鼠血清特异性抗体均呈有意义的提高。结论:结核杆菌Ag85A与mIL21共表达DNA疫苗能诱导小鼠免疫反应,为进一步研究DNA疫苗抗结核杆菌攻击的免疫防护效应奠定了基础。     

口服结核Ag85A-CD226 DNA疫苗在小鼠脾与肠道的表达水平检测

目的了解结核Ag85A-CD226 DNA疫苗经灌胃方式接种小鼠后在脾淋巴细胞与肠道的表达情况。方法将构建的pcDNA3.1-Ag85A-CD226、pcDNA3.1-Ag85A和pcDNA3.1-CD226真核表达质粒转化DH5α感受态大肠杆菌,扩增并提取纯化质粒,用脂质体包裹制成DNA疫苗。经灌胃方式将制备的DNA疫苗接种C57BL/6小鼠,设置Ag85A-CD226疫苗组、Ag85A疫苗组、CD226疫苗组、pcDNA3.1质粒组和生理盐水对照组。采用间接免疫荧光法检测Ag85A和CD226在肠道的表达。采用流式细胞术检测脾CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的CD226表达。结果 CD226在Ag85A-CD226疫苗组脾脏CD4+T细胞和NK细胞的表达均明显强于Ag85A疫苗组、CD226疫苗组、pcDNA3.1质粒组和生理盐水对照组,差异具有统计学意义(P0.01);CD226在Ag85A-CD226疫苗组脾脏CD8+T细胞的表达明显强于Ag85A疫苗组、pcDNA3.1质粒组和生理盐水对照组,差异具有统计学意义(P0.01),与CD226疫苗组相比虽有所增加,但差异无统计学意义(P0.05)。CD226在Ag85A-CD226疫苗组小肠派氏淋巴结表达明显强于Ag85A疫苗组、CD226疫苗组、pcDNA3.1质粒组和生理盐水对照组,差异具有统计学意义(P0.01)。Ag85A只在Ag85A-CD226疫苗组和CD226疫苗组小肠固有层表达,且在Ag85A-CD226疫苗组的表达明显强于CD226疫苗组,差异具有统计学意义(P0.01)。结论 Ag85A-CD226 DNA疫苗接种后,CD226在脾淋巴细胞和肠道表达增强,Ag85A在肠道表达增强,CD226的表达增加会增强Ag85A在肠道的表达水平。     

小鼠对结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫反应

目的研究结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫原性。方法将40只BALB/c小鼠随机分成4组,NS组、BCG组、pcDNA-HspX组和pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX组,每组10只。BCG组只在0周时皮内注射卡介苗1次。NS组、pcDNA-HspX组及融合基因组分别于0、2、4周肌肉注射生理盐水和重组质粒DNA,共免疫3次。在免疫的第2周,4周及最后一次免疫后2周检测体血清中的总IgG水平。同时,最后一次免疫后2周,取脾细胞检测细胞免疫反应。结果构建的融合基因重组质粒DNA免疫动物后能产生针对结核杆菌特定抗原的特异性细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因可作为DNA疫苗进行保护作用的研究。     

分枝杆菌Ag85A DNA疫苗对膀胱癌小鼠细胞免疫功能的影响

为探讨分枝杆菌Ag85A DNA疫苗能否提高荷膀胱癌小鼠保护性免疫应答水平,将1×10^6个MBT-2细胞注射于C3H/HeN小鼠的右侧背部皮内,待肿瘤长至直径约5～8 mm时,将动物随机分成实验组、空质粒组和空白对照组3组,分别于小鼠双侧股四头肌内注射Ag85A-V1 Jns.tPA质粒,V1 Jns.tPA质粒总量0.1 mL（100μg）,或生理盐水0.1 mL,每14 d 1次,共3次,末次免疫后第14天分别检测T细胞亚群数量、NK细胞活性、FasL mRNA表达情况、淋巴细胞增殖水平及肿瘤重量。结果显示,实验组较空白质粒组和空白对照组免疫指标均无明显增高（P〉0.05）,提示肌肉注射Ag85A DNA疫苗不能明显提高荷瘤小鼠免疫功能。     

DNA疫苗初免-BCG加强免疫法提高小鼠抗结核分枝杆菌感染效率的研究

对结核分枝杆菌DNA四价疫苗(编码Ag85B,MPT64,MPT70和TB10.4抗原)初发免疫、卡介苗(BCG)加强免疫后小鼠产生免疫应答的能力和抗结核杆菌感染效率进行了分析.攻毒后细菌计数结果显示,DNA初免、BCG加强组肺脏和脾脏载菌数的对数值比阴性对照组下降1.0～1.3(P<0.01),且显著低于DNA四价苗和BCG组(P<0.05).3次免疫后,BCG加强组外周血中CD4 和CD8 T淋巴细胞显著增多(P<0.05);经4种抗原分别刺激,BCG加强组脾细胞产生的抗原特异性IFN-γ和IL-2水平显著高于其他免疫组,其中Ag85B抗原诱导产生的IFN-γ浓度为1250ng/L,IL-2浓度为230ng/L,分别是DNA四价苗组的1.6,1.7倍(P<0.05),是BCG组PPD诱导产生相应细胞因子浓度的2.6倍和2.2倍(P<0.05);此外,BCG加强组肺脏中分泌穿孔素的淋巴细胞数量也显著增加(P<0.05).结果表明,DNA初发免疫、BCG加强免疫法能显著提高小鼠CD4 ,CD8 T细胞介导的免疫应答,增强小鼠抗结核杆菌感染能力,是提高结核病疫苗免疫效果的新途径.     

牛分枝杆菌单基因及双价融合基因DNA疫苗免疫效果的研究

利用PCR技术和SOE技术扩增牛分枝杆菌ag85b、esat-6、hsp65、mpb64基因和ag85b-esat-6、hsp65-esat-6和mpb64-esat-6融合基因,连接真核表达载体pCDNA3.1(+),构建重组质粒pCA、pCE6、pCH、pCM、pCAE、pCHE和pCME。转染SP2/0细胞,检测目的基因的表达。以各重组质粒和pCDNA3.1(+)及PBS免疫BALB/c小鼠后检测血清特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖情况和IFN~γ分泌情况。结果表明,七种重组质粒免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,与 pCDNA3.1(+)对照组和PBS对照组相比差异显著 （P<0.05）,其中pCA组血清抗体水平明显高于其他六种DNA疫苗免疫组 （P<0.05）;三免两周后,融合基因免疫组的刺激值（SI值）与单基因免疫组相比差异显著（P<0.05）,其中以pCME组的SI值最高;PPD刺激后融合基因DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN~γ高于单基因DNA疫苗组（P<0.05）,而两对照组则未检测到IFN~γ的产生。本试验成功构建了牛分枝杆菌ag85b、esat-6、hsp65、mpb64单基因和ag85b-esat-6、hsp65-esat-6、mpb64-esat-6双价融合基因DNA疫苗,从而为牛结核病新型疫苗的研制奠定了基础。     

真核表达编码Ag85A基因重组体的构建

抗原85复合体（Ag85）是BCG合成的能够刺激机体产生细胞免疫和体液免疫的多种成分之一,Ag85A是抗原85复合体组成成分之一,可显著刺激细胞免疫功能增强。为研究经口接种Ag85A的DNA疫苗的免疫效应,根据结核分枝杆菌Ag85A的基因序列自行设计了一对PCR引物,以人型结核杆菌H37Rv标准毒力株的DNA为模板,经过PCR扩增出Ag85A目的基因,纯化PCR产物TA克隆入载体pUCm-T载体,蓝白斑筛选将回收的PCR产物用限制性核酸内切酶Xhol和BamHI双酶酶切后,经T4DNA连接酶作用,与真核表达载体pCDNA3．1^＋连接,筛选得到的阳性克隆经DNA测序鉴定证实为Ag85A基因,且被克隆到载体pCDNA3．1^＋中的CMV启动子的下游,成功构建并鉴定的真核表达载体pCDNA3．1^＋携带Ag85A基因的重组体,命名为pCDNA3．1^＋／Ag85A。将其转化大肠埃希菌并使之大量扩增,并采用无内毒素提取质粒方法收集此重组质粒DNA．即为可经口途径喂饲小鼠的结核杆菌Ag85A的DNA疫苗,为口服DNA疫苗的临床应用研究奠定基础。     

结核分枝杆菌抗原重组酿酒酵母免疫诱导小鼠特异性免疫应答

近年来基于重组酿酒酵母全细胞的新型疫苗研究报道不断出现。以结核杆菌重要保护抗原ESAT6和Ag85B为对象,采用pHR酿酒酵母表达系统,构建了两种分别表达ESAT6-Ag85B(EA)和IFN-γ-ESAT6-Ag85B(IEA)融合抗原的重组酿酒酵母Yeast-EA和Yeast-IEA。重组酵母以皮下注射方式免疫小鼠后,小鼠产生高水平Ag85B特异性抗体,淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2等细胞因子,无IL-4产生,发生Th1型细胞免疫应答,其中Yeast-IEA效应更强,优于传统的BCG疫苗。实验证实重组酵母能够刺激树突状细胞的成熟分化。研究结果显示结核分枝杆菌抗原重组酿酒酵母全细胞疫苗具有发展成为新型抗结核疫苗的潜力。     

人白细胞介素12表达质粒与Mtb8.4基因疫苗 联合免疫增强对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果

本课题旨在研究结核分枝杆菌Mtb8.4基因疫苗与人白细胞介素12（hIL-12）联合免疫小鼠所诱导的细胞免疫应答及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。40只C57BL/6N小鼠随机分为Mtb8.4基因疫苗＋hIL-12质粒组（联合免疫组）、Mtb8.4基因疫苗组、卡介苗（BCG）组、空载体组和PBS组,基因疫苗、空载体和PBS,经肌内注射法免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次,BCG组经尾部皮下注射1×106 CFU BCG免疫1次。免疫4周后,每组处死3只小鼠,采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测脾细胞培养上清中细胞因子水平;乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测细胞毒性T细胞（CTL）杀伤活性。每组其余5只小鼠用结核杆菌H37Rv强毒株经尾静脉攻击,4周后,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z-N染色查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果显示,联合免疫组能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液IFN-γ和IL-2水平（分别为1493.34±8.128pg/mL、747.489±48.676pg/mL）,显著高于Mtb8.4基因疫苗组,与BCG组相当,IL-4分泌减少,特异性CTL杀伤活性增强,对小鼠结核杆菌感染有较好的免疫保护效果,使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数显著减少,组织病变明显减轻,其效果与卡介苗（BCG）组相当,优于Mtb8.4基因疫苗组。表明hIL-12表达质粒与Mtb8.4基因疫苗联合免疫后,能够增强Mtb8.4基因疫苗所诱导的细胞免疫应答,使Mtb8.4基因疫苗的免疫效力得到很大提高。     

Mucosal administration of Ag85B-ESAT-6 protects against infection with Mycobacterium tuberculosis and boosts prior bacillus Calmette-Guerin immunity

We have examined the intranasal administration of a vaccine against Mycobacterium tuberculosis (M.tb) consisting of the mucosal adjuvant LTK63 and the Ag Ag85B-ESAT-6. Vaccination with LTK63/Ag85B-ESAT-6 gave a strong and sustained Th1 response mediated by IFN-gamma-secreting CD4 cells, which led to long-lasting protection against tuberculosis, equivalent to that observed with bacillus Calmette-Guérin (BCG) or Ag85B-ESAT-6 in dimethyldioctadecylammonium bromide/monophosphoryl lipid A. Because a crucial element of novel vaccine strategies is the ability to boost BCG-derived immunity, we also tested whether LTK63/Ag85B-ESAT-6 could act as a BCG booster vaccine in BCG-vaccinated mice. We found that vaccinating with LTK63/Ag85B-ESAT-6 strongly boosted prior BCG-stimulated immunity. Compared with BCG-vaccinated nonboosted mice, we observed that infection with M.tb led to a significant increase in anti-M.tb-specific CD4 T cells in the lungs of LTK63/Ag85B-ESAT-6-boosted animals. This correlated with a significant increase in the protection against M.tb in LTK63/Ag85B-ESAT-6-boosted mice, compared with BCG-vaccinated animals. Thus, LTK63/Ag85B-ESAT-6 represents an efficient preventive vaccine against tuberculosis with a strong ability to boost prior BCG immunity.     

受体相互作用蛋白激酶-3参与甲型H1N1流感病毒感染小鼠记忆性CD8＋ T细胞的应答

受体相互作用蛋白激酶-3(receptor-interacting protein kinase 3, RIPK3)是坏死复合体的关键成分之一,介导细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)的发生。前期研究发现流感抗原特异性CD8^＋T细胞的初次应答部分依赖于RIPK3分子,为探讨其在记忆性CD8^＋T细胞应答中的作用,对初次感染后的C57BL/6小鼠在免疫记忆阶段进行了再次感染,并用流式细胞仪检测了流感病毒特异性的记忆性CD8^＋T细胞的表型和功能。结果发现小鼠初次感染甲型 H1N1流感病毒株A/Puerto Rico/8/34后37 d, RIPK3敲除小鼠的CD8^＋T细胞比例及分泌细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的能力均显著低于野生型小鼠;在再次感染相同病毒时,RIPK3敲除小鼠流感病毒特异性CD8^＋T细胞比例及分泌细胞因子IFN-γ的能力依旧显著低于野生型小鼠;而CD8^＋中枢型记忆性T细胞(TCM)比例显著高于野生型小鼠,效应型记忆性T细胞(TEM)或效应性T细胞(TEff)比例却显著低于野生型小鼠。提示RIPK3分子参与调节流感病毒特异的记忆性CD8^＋T细胞诱生数量和分泌细胞因子功能,并影响其TCM与TEM/TEff的比例,为深入探索病毒特异的记忆性CD8^＋T细胞应答的分子机制提供了新线索。     

Improving vaccines against tuberculosis

Tuberculosis remains a major cause of mortality and physical and economic deprivation worldwide. There have been significant recent advances in our understanding of the Mycobacterium tuberculosis genome, mycobacterial genetics and the host determinants of protective immunity. Nevertheless, the challenge is to harness this information to develop a more effective vaccine than BCG, the attenuated strain of Mycobacterium bovis derived by Calmette and Guérin nearly 90 years ago. Some of the limitations of BCG include the waning of the protective immunity with time, reduced effectiveness against pulmonary tuberculosis compared to disseminated disease, and the problems of a live vaccine in immuno-compromised subjects. Two broad approaches to vaccine development are being pursued. New live vaccines include either attenuated strains of Mycobacterium tuberculosis produced by random mutagenesis or targeted deletion of putative virulence factors, or by genetic manipulation of BCG to express new antigens or cytokines. The second approach utilizes non-viable subunit vaccines to deliver immunodominant mycobacterial antigens. Both protein and DNA vaccines induce partial protection against experimental tuberculosis infection in mice, however, their efficacy has generally been equivalent to or less than that of BCG. The comparative effects of cytokine adjuvants and vaccines targeting antigen presenting cells on enhancing protection will be discussed. Coimmunization with plasmid interleukin-12 and a DNA vaccine expressing Antigen 85B, a major secreted protein, was as protective as BCG. The combination of priming with DNA-85B and boosting with BCG was superior to BCG alone. Therefore it is possible to achieve a greater level of protection against tuberculosis than with BCG, and this highlights the potential for new tuberculosis vaccines in humans.     

重庆地区人类免疫缺陷病毒携带者的微孢子虫感染情况调查

目前我国关于微孢子虫感染人的研究相对较少,更没有关于重庆地区人类免疫缺陷病毒(HIV)携带者感染微孢子虫的数据统计。对重庆市公共卫生医疗救治中心收治的22例HIV抗体阳性,但尚未接受抗病毒治疗的患者进行研究。将22例患者粪便样本分别提取总DNA,通过聚合酶链反应(PCR)法和DNA测序等技术对微孢子虫在患者中的感染情况进行检测,并对微孢子虫种类进行鉴定。同时对22例患者的免疫细胞亚群进行计数和分析。结果显示,微孢子虫的感染率为36.3%(8/22),主要由脑炎微孢子虫属(Encephalitozoon spp)的海伦脑炎微孢子虫(E. hellem)和肠脑炎微孢子虫(E. intestinalis)引起。22例患者的免疫细胞亚群分析显示,平均淋巴细胞数0.93±0.13×10⁹/L,CD4^＋T细胞数132±22 个/mL,CD8^＋T细胞数495±91 个/mL,CD4/CD8细胞比值0.37±0.1,表明患者免疫功能受到严重抑制。进一步将微孢子虫感染患者与未感染患者的免疫细胞亚群进行比较发现,感染患者淋巴细胞数为0.51±0.1×10⁹/L,未感染患者为1.17±0.17 ×10⁹/L,两者具有显著差异(P<0.05);感染患者CD4^＋T细胞数为71±27 个/mL,未感染患者为167±28 个/mL,两者具有显著差异(P<0.05);感染患者CD8^＋T细胞数为209±35 个/mL,未感染患者为658±123 个/mL,两者具有显著差异(P<0.05),以上表明微孢子虫感染组的免疫功能受损情况更严重。本研究结果提示微孢子虫的机会性感染与患者免疫功能受损情况密切相关,脑炎微孢子虫属在重庆地区有较高的感染率,这为进一步阐明微孢子虫与宿主相互作用关系奠定基础,也为公共卫生健康管理提供重要参考。     

Recombinant BCG Expressing Mycobacterium ulcerans Ag85A Imparts Enhanced Protection against Experimental Buruli ulcer

Buruli ulcer, an emerging tropical disease caused by Mycobacterium ulcerans (MU), is characterized by disfiguring skin necrosis and high morbidity. Relatively little is understood about the mode of transmission, pathogenesis, or host immune responses to MU infection. Due to significant reduction in quality of life for patients with extensive tissue scarring, and that a disproportionately high percentage of those affected are disadvantaged children, a Buruli ulcer vaccine would be greatly beneficial to the worldwide community. Previous studies have shown that mice inoculated with either M. bovis bacille Calmette–Guérin (BCG) or a DNA vaccine encoding the M. ulcerans mycolyl transferase, Ag85A (MU-Ag85A), are transiently protected against pathology caused by intradermal challenge with MU. Building upon this principle, we have generated quality-controlled, live-recombinant strains of BCG and M. smegmatis which express the immunodominant MU Ag85A. Priming with rBCG MU-Ag85A followed by an M. smegmatis MU-Ag85A boost strongly induced murine antigen-specific CD4⁺ T cells and elicited functional IFNγ-producing splenocytes which recognized MU-Ag85A peptide and whole M. ulcerans better than a BCG prime-boost vaccination. Strikingly, mice vaccinated with a single subcutaneous dose of BCG MU-Ag85A or prime-boost displayed significantly enhanced survival, reduced tissue pathology, and lower bacterial load compared to mice vaccinated with BCG. Importantly, this level of superior protection against experimental Buruli ulcer compared to BCG has not previously been achieved. These results suggest that use of BCG as a recombinant vehicle expressing MU antigens represents an effective Buruli ulcer vaccine strategy and warrants further antigen discovery to improve vaccine efficacy.     

新型抗结核蛋白亚单位疫苗Ag85A-γ干扰素的免疫效果评价

本研究旨在评价新型抗结核融合蛋白亚单位疫苗Ag85A-γ干扰素(Ag85A-IFN-γ)的免疫效果.在成功表达并纯化了去除Ag85A信号肽的融合蛋白Ag85A-IFN-γ后,将其与免疫佐剂二甲基三十六烷基铵(DDA)混合,皮下免疫C57BL/6小鼠3次,每次间隔2周,末次免疫2周后进行效果评价.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中IgG、IgG1和IgG2c水平.结果显示,融合蛋白Ag85A-IFN-γ组的IgG水平均高于单独抗原组,且融合蛋白组IgG2c/IgG1 比值显著高于对照组,表明融合蛋白能刺激宿主产生更强烈的体液免疫反应,更倾向于激发T辅助细胞1型(Th1型)免疫反应.流式细胞术检测特异性CD4+和CD8+ T细胞比例,发现Ag85A-IFN-γ组CD8+/CD4+最高,显示该融合蛋白能显著增强CD8+ T细胞增殖.上述结果表明,融合蛋白Ag85A-IFN-γ有望成为有效的新型抗结核融合蛋白亚单位疫苗.