PCR-mtDNA技术鉴别检测不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分

以鸭肌肉组织DNA为模板,利用PCR-mtDNA技术成功克隆出了鸭mtDNA COIII基因(GenBank Accession No.DQ655706).对所克隆的序列分析表明.其序列包括鸭细胞色素C氧化酶III(COIII)基因全序列784 bp,通过同源性分析可知,动物的线粒体DNA COIII基因是相对保守的,利用此特性设计PCR-mtDNA方法鉴别检测鸭源性成分的特异性引物;以各种动物肌肉组织及饲料DNA为模板进行PCR扩增、经反复验证筛选出只能扩增出鸭DNA的目的片段,而不能扩增出其他动物DNA片段的特异性强、稳定性好的引物P3、P4;利用此引物PCR扩增鸭DNA的特异性片段为226 bp,对PCR产物进行测序分析可知与已克隆的鸭mtDNA COIII基因同源性达到100%,证明了所筛选引物的准确性.通过对不同含量的DNA模板溶液进行PCR扩增的方法,对筛选出的特异性引物P3、P4进行灵敏度试验,结果分析表明灵敏度约为0.001%,证明该PCR方法具有特异性强、灵敏度高的特点,完全可作为鉴别不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分的方法.     

基因导流杂交法于低密度基因芯片平台上检测乙肝病毒

运用基因导流杂交法在低密度基因芯片平台上检测乙肝病毒DNA（HBV DNA）。设计特异性引物,对HBV基因组DNA中的编码HBV多聚酶蛋白的一段序列进行PCR扩增;根据被扩增片段,设计保守的特异性探针,并将该探针固定在杂交膜上,制备低密度基因芯片：使用导流杂交法将上述扩增产物和低密度基因芯片进行杂交,根据显色反应判断被检测样本有无HBV DNA。基因导流杂交法在低密度基因芯片平台上可以方便、快速、准确地检测乙肝病毒。     

一枚恐龙蛋内细胞色素b基因片段的序列分析

用一对根据人线粒体细胞色素ｂ基因保守区序列设计的引物,以一枚恐龙蛋内ＤＮＡ为模板,在ＰＣＲ上扩增出大约１７０ｂｐ的基因片段。序列测定后经ＩＮＴＥＲＮＥＴ联网的ＢＬＡＳＴ数据库类似性检索,结果表明,该序列与人类线粒体细胞色素ｂ基因的序列完全相同（９６－１００％相似）。因此,可以肯定实验材料本身有严重污染。     

复合PCR扩增人mtDNA HVR方法的初探

目的:建立一种高效的扩增线粒体DNA高可变区(mtDNA HVR)的方法.方法:本研究选取5例健康成人静脉血,用人血全基因组DNA试剂盒,提取全基因组DNA,设计引物,用复合PCR方式,对线粒体DNA中的高可变区进行扩增.复合扩增的方式为:用6对套叠引物分开进行两次独立的PCR,扩增mtDNA HVR.第一次扩增用3对引物,目标DNA片段基本涵盖整个线粒体DNA的高可变区,扩增后得到互不重叠的3个短片段,分别为113 bp,126 bp和131bp.第二次复合扩增用其余的3对引物,目标片段基本重叠在第一次扩增所得的目标片段的区域内,扩增得到3个互不重叠的片段为124 bp,133 bp和93bp.所有扩增产物经过纯化后测序.结果:复合PCR方式获得的mtDNA HVR基因序列完整,5个样本均出现特异性条带,电泳结果条带单一、清晰.结论:复合扩增PCR方法对mtDNA HVR区的扩增效率高,测序结果稳定,结合6对套叠引物,不但保证了序列的完整性,另外,两次独立的PCR也减少了PCR反应过程中错配的发生,此法也适用于保存时间较久的古代线粒体DNA短片段的研究.复合扩增PCR还展示出了潜在的高产量的特点,相对传统PCR显示了其更多的优势.     

羊驼性别决定基因sry部分片段的克隆与序列分析

从成年羊驼血液提取基因组DNA,参照哺乳动物sry(sex-determining region on the Y chromosome)基因的同源保守区域设计特异性引物,用PCR技术成功扩增羊驼sry基因的部分片段,且全部实验雄性个体均成功扩增,而雌性个体则无任何特异性片段,说明所扩增基因片段具雄性特异性。对扩增序列所编码蛋白序列分析显示所扩增的片段编码的蛋白序列在哺乳动物sryHMG-box(high mobility group box)蛋白超家族的HMG-box区域,说明扩增的为sry基因片段。用所扩增片段与其他哺乳动物同源序列分析显示,由sry基因构建的系统进化树,与传统的动物分类关系相近,说明由sry基因的HMG-box构建系统树是分析物种亲缘关系的有效工具。     

甲基化特异性PCR检测FMR1 和XIST基因甲基化实验方法的建立

建立一种快速、灵敏的检测脆性X智障基因（Fragile X mental retardation, FMR1）和X染色体失活基因（X chromosome inactivation,XIST）甲基化的方法,用亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行脱氨基修饰。以修饰后的DNA为模板,用两套不同的引物对：1对甲基化特异性引物和1对非甲基化特异性引物扩增FMR1基因（CGG）n重复序列区、FMR1 和XIST 基因的启动子区。PCR产物进一步克隆、测序。以亚硫酸氢钠和对苯二酚脱氨基修饰后的DNA为模板,进行PCR扩增后的产物与预期基因目的基因片段大小相符合,无非特异性扩增产物。测序结果表明,FMR1、XIST基因中的非甲基化的C碱基转变为U碱基,而CpG岛被甲基化的C碱基不改变。成功地建立了检测FMR1、XIST甲基化的方法,为实验室诊断脆性X综合征提供了新的方法。     

猴D型反转录病毒巢式PCR检测方法的建立

目的建立SRV-1巢式PCR检测方法并进行初步应用。方法针对SRV-1env基因的保守区序列,设计特异性引物,以感染SRV-1 Raji细胞提取出的含有前病毒DNA的基因组DNA为模板,进行巢式PCR反应。扩增产物测序后与GenBank报道的序列进行同源比对。将DNA样本进行10倍梯度稀释,以检测巢式PCR反应的灵敏度。使用该方法对正常Raji细胞以及感染SIV、STLV的外周血淋巴细胞DNA样本进行扩增,检测该方法的特异性。用建立的巢式PCR方法检测40份储存猴血标本。结果使用巢式PCR扩增出的特异片段经测序分析,结果证实与GenBank报道的序列一致。所建立的巢式PCR检测法检测限度可达1.5×10-3ng/μL,而且方法特异。用此方法检测40份猴血标本,未检测到阳性标本。结论初步建立SRV-1的巢式PCR检测方法,该方法灵敏、特异,为SRV-1的检测提供了一个快速、有效的手段。     

食品中沙门氏菌分子检测靶点的筛选与评价

[目的]发掘新的沙门氏菌分子检测靶点,筛选检测性能优秀的引物.[方法]利用BLAST程序比较沙门氏菌属内基因组DNA序列的同源性以及沙门氏菌与非沙门氏菌基因组DNA序列之间的特异性,发掘出100多个检测沙门氏菌属的特异性片段,并从中随机挑选出15个片段作为候选靶点,一共设计了27对引物(FS1～FS27),对它们的特异性、灵敏度加以评价,从中筛选检测性能最好的引物.[结果]在27对引物中,检测性能最优的引物为FS23,采用该引物对供试菌株的相应检测靶点进行PCR扩增,44株沙门氏菌都能扩增到一条492 bp特异性片段,而22株非沙门氏菌则不能扩增出这一特异性片段.以FS23为引物建立PCR方法检测猪霍乱沙门氏菌基因组DNA的灵敏度为11.9 fg/μL,细菌纯培养物灵敏度为4.9×102cfu/mL;用猪霍乱沙门氏菌人工污染牛奶样品,如果接种起始菌量为100 cfu/25 mL时,只需要增菌5 h,采用上述方法即能检测出沙门氏菌.[结论]引物FS23对应的基因序列是一个性能优良的新分子检测靶点,具备很高的特异性和灵敏性,能够广泛应用于食品中沙门氏菌的快速检测.     

猪FGL2基因cDNA末端序列检测及结构分析

检测猪FGL2基因cDNA末端序列并对该基因结构初步分析。α-32P dCTP放射性同位素标记cDNA探针筛选猪基因组DNA文库;cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end,RACE)。以猪正常小肠及心脏组织提取新鲜总RNA,反转录后作为模板,设计基因特异性引物,采用Advantage 2 聚合酶混合物进行PCR扩增;依据猪与人FGL2基因3′端已知同源序列设计PCR上游引物,以人FGL2基因3′末端序列设计下游引物,以猪基因组DNA为模板采用Advantage 2 聚合酶混合物进行PCR反应;PCR载体重组质粒DNA亚克隆扩增。同位素探针未能筛选到特异阳性克隆,RACE反应检测到特异性转录起始位置及第一个转录终止位置,但仍未检测到第二个转录终止位置。猪基因组DNA行PCR扩增成功检测到猪FGL2基因3′末端未知序列及第二个转录终止位置。     

植物叶绿体与线粒体基因组DNA特异性比较研究

研究不同植物间叶绿体和线粒体基因组DNA的差异,探讨其在法庭科学中的应用价值.根据叶绿体和线粒体基因组DNA核苷酸序列的特点,分别设计了一系列相应的引物,经PCR扩增后,电泳鉴别不同的植物.结果表明在设计的一系列引物中,叶绿体基因组DNA的PCR产物差异不大,鉴别效果不明显;而线粒体基因DNA的PCR产物差异大,鉴别效果明显.因此以线粒体DNA为模板进行PCR扩增,在不同植物间存在良好的差异性,适合于不同植物间的鉴别,在法庭科学中具有实际应用价值.     

赤麂线粒体全基因组的序列和结构

提取赤麂细胞株总DNA,参照我们实验室已测定的同属动物小麂线粒体全基因组序列设计引物,PCR扩增、测序、拼接,获得赤麂线粒体全基因组序列并进行生物信息学分析。赤麂线粒体全基因组序列全长16354bp。定位了22个tRNA基因、2个rRNA基因、13个蛋白编码基因和1个D-loop区。赤麂与小麂及其它哺乳动物线粒体的基因组结构相同,它们的序列同源性都较高。     

东方田鼠特异DNA片段的克隆及核苷酸序列分析

目的获得东方田鼠的特异DNA序列.方法Aβ基因使用PCR,基因克隆,斑点杂交,DNA序列分析,生物信息学技术.结果根据小鼠MHCⅡ外显子2及其两侧序列,合成引物并扩增东方田鼠基因组DNA,将PCR产物回收、测序后,分别设计内引物扩增东方田鼠基因组DNA,其中一对引物可得到特异性扩增带,将得到的DNA片段插入PGEM-Teasy载体,进行序列分析.用这对引物扩增人、昆明小鼠、BALB/c小鼠及C57BL/6J小鼠基因组DNA,均无扩增产物.以东方田鼠特异性扩增产物为探针进行斑点杂交,除东方田鼠基因组DNA外,其他几种动物基因组DNA均为阴性结果.进一步对该DNA片段进行了BLAST同源性搜索和外显子预测,在Genbank中没有发现高度同源序列,并且找到一个可能的外显子,该外显子由69个氨基酸组成.结论获得的DNA片段为东方田鼠的特异片段,这将为从分子水平深入研究东方田鼠的遗传背景、生物进化规律以及东方田鼠抗日本血吸虫的机理奠定基础.     

应用长PCR扩增蝗虫线粒体全基因组

介绍了用两对长PCR引物扩增蝗虫(Acridoidea)线粒体全基因组的方法。从NCBI的核酸数据库下载得到36种已测昆虫线粒体全基因组,选取cytochromeb(Cytb)c、ytochrome oxidase subunitⅡ(COⅡ)、cytochrome oxidase subunitⅠ(COⅠ)基因的保守区域设计两对引物。其中引物LP03和LP04从COⅠ向Cytb扩增;引物LPCytb和LPCOⅡ从Cytb向COⅡ扩增,两对引物扩增的片段之间有大约1 kb的重叠。应用这两对引物成功扩增出10种蝗虫的线粒体基因组。考虑到在设计引物过程中所选序列在其他昆虫中的保守性,它们应能在大部分昆虫线粒体基因组扩增中发挥作用。     

应用PCR方法鉴别猪肉和牛肉

参考已有文献建立了一种快速检测猪肉和牛肉的PCR实验方法。首先,提取基因组DNA,设计针对目的基因的特异性引物,其次,通过PCR方法扩增特异性DNA片段,再利用琼脂糖凝胶电泳予以分离和鉴定,根据DNA分子量的大小及测序结果,鉴别、确认不同的肉类样品。本实验方法简便、特异性高,不仅可作为教学实验,也可用于肉制品的检测。     

转基因大豆非同源对照模板QC-PCR检测方法的建立

建立了转基因大豆CP4EPSPS基因的非同源对照模板QC-PCR检测方法。非同源竞争对照构建方法如下:利用CP4EPSPS基因特异引物,以大肠杆菌基因组DNA为异源模板,在低严谨度PCR扩增,回收适宜DNA片段并克隆到pMD-8载体上。该片段与CP4EPSPS基因相应序列除两端引物序列完全相同外,其他部分没有同源性。     

人源化小鼠人源细胞检测方法

目的人源化小鼠在人类疾病与再生医学研究中具有广泛应用,为获得一种理想的人源化小鼠检测方法,研究人特异性线粒体序列扩增作为人源化动物模型中人类DNA检测方法的可行性。方法设计人线粒体DNA特异性引物,并用该引物对人脐血造血干细胞嵌合体小鼠进行了检测。结果在人源化动物模型的人类DNA检测中,这种人线粒体DNA的PCR检测方法能够达到理想的特异性与灵敏性,是一种理想的嵌合体小鼠检测方法。结论获得了一种理想的人源化小鼠人源细胞检测方法。     

利用12S rRNA、COI基因分子标记鉴定少棘巨蜈蚣干燥体

本研究旨在利用线粒体DNA上的12S rRNA基因、COI基因分子标记鉴定少棘巨蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch)干燥体。通过提取少棘巨蜈蚣干燥体样本DNA,PCR扩增线粒体DNA上的12S r RNA基因、COI基因片段,对PCR产物进行电泳检测及测序分析,测序结果在GenBank上进行BLAST搜索,同源性分析,并用MEGA7.0软件对所有实验样品及少棘巨蜈蚣的近缘物种进行遗传距离分析、构建邻接(NJ)树以验证序列比对结果。结果表明,从少棘巨蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch)干燥体中成功地提取到了基因组总DNA,并成功扩增出了用于动物种属鉴定的12S rRNA、COI基因片段。但所得蜈蚣样本12S rRNA基因片段序列与NCBI的GenBank中的物种的同源性无90%以上的。通过文献调研发现尚无蜈蚣12S rRNA基因片段的相关报道,将该序列作为新的基因序列注册到NCBI基因数据库中,该基因片段序列的GenBank登录号为JN558832.1。这说明利用线粒体DNA上的12S rRNA、COI基因DNA分子标记皆可准确鉴定动物种属。本研究得到的12S rRNA基因片段序列可作为后续准确鉴定少棘巨蜈蚣药材的分子标记参考。     

苎麻疫霉激发蛋白基因断裂现象初探*

苎麻疫霉(Phytophthora boehmeriae Saw.)可分泌具有诱抗作用的激发蛋白(a-elicitin),根据a-elicidn第24～30和56～63位保守区氨基酸推导的寡核苷酸引物序列,对苎麻疫霉基因组DNA进行特异PCR扩增反应,发现其扩增的DNA片段大于预计的片段。回收纯化的特异扩增DNA,并进行克隆和测序分析,结果表明特异扩增的elicitin基因亚克隆DNA为570bp,大于预计的117bp。在特异片段中,存在3个内含子将基因断裂成4个阅读框架,即ORF1、ORF2、ORF3和ORF4,其中ORF1和ORF4含有与引物相同的序列,但与其它序列与已克隆的elicitin基因无同源性。因此,苎麻疫霉基因组中的elicitin基因可能存在断裂现象。     

苎麻疫霉激发蛋白基因断裂现象初探

苎麻疫霉（PhytophthoraboehmeriaeSaw．）可分泌具有诱抗作用的激发蛋白（α－elicihn）,根据α－elicitin第24～30和56～63位保守区氨基酸推导的寡核苷酸引物序列,对苎麻疫霉基因组DNA进行特异PCR扩增反应,发现其扩增的DNA片段大于预计的片段。回收纯化的特异扩增DNA,并进行克隆和测序分析,结果表明特异扩增的elicihn基因亚克隆DNA为570hp,大于预计的117bp。在特异片段中,存在3个内含子将基因断裂成4个阅读框架,即ORF1、ORF2、ORF3和ORF4,其中ORF1和ORF4含有与引物相同的序列,但与其它序列与已克隆的elicihn基因无同源性。因此,芒麻疫霉基因组中的elicitin基因可能存在断裂现象。     

裸长角(虫兆)线粒体COI基因扩增的研究

目的:为研究跳虫的遗传多样性和探讨跳虫线粒体基因提取与扩增的简易方法,对裸长角(虫兆)线粒体细胞色素氧化酶亚基COI基因进行了提取和扩增.方法:通过采集裸长角(虫兆)、提取裸长角虫兆基因组DNA,并用特异性引物对COI基因进行PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳来检验扩增产物,最后用软件对结果进行分析.结果:结果显示扩增产物的为一明亮条带,长度约为477bp,符合预期.结论:用基因组DNA作为扩增模板是可行的,所选用的引物对跳虫线粒体细胞色素氧化酶基因的扩增具有参考价值.