苎麻疫霉激发蛋白基因断裂现象初探

苎麻疫霉（PhytophthoraboehmeriaeSaw．）可分泌具有诱抗作用的激发蛋白（α－elicihn）,根据α－elicitin第24～30和56～63位保守区氨基酸推导的寡核苷酸引物序列,对苎麻疫霉基因组DNA进行特异PCR扩增反应,发现其扩增的DNA片段大于预计的片段。回收纯化的特异扩增DNA,并进行克隆和测序分析,结果表明特异扩增的elicihn基因亚克隆DNA为570hp,大于预计的117bp。在特异片段中,存在3个内含子将基因断裂成4个阅读框架,即ORF1、ORF2、ORF3和ORF4,其中ORF1和ORF4含有与引物相同的序列,但与其它序列与已克隆的elicihn基因无同源性。因此,芒麻疫霉基因组中的elicitin基因可能存在断裂现象。     

苎麻疫霉激发蛋白基因断裂现象初探

苎麻疫霉可分泌具有诱抗作用的激发蛋白（α－ｅｌｉｃｉｔｉｎ）,根据α－ｃｌｉｃｉｔｉｎ第２４￣３０和５６￣６３位保守区氨基酸推导的寡核苷酸引物序列,对苎麻疫霉基因组ＤＮＡ进行特异ＰＣＲ扩增反应,发现其扩增的ＤＮＡ片段大于预计的片段。回收纯化的特异扩增ＤＮＡ,并进行克隆和测序分析,结果表明特异扩增的ｃｌｉｃｉｔｉｎ基因亚克隆ＤＮＡ为５７０ｂｐ,大于预计的１１７ｂｐ。在特异片段中,存在３个内含子将基因     

雄牛特异的SRY同源序列的扩增和分析

利用人、兔、鼠SRY序列设计引物,应用PCR扩增牛的SRY序列,获得200bp的雄牛特异的扩增片段。克隆该扩增片段,获得重组质粒pCH21,进行序列分析,并与人、兔和鼠SRY的对应区域比较,具有高度同源性。用pCH21 DNA作探针与牛的基因组DNA酶切图谱杂交,显示了雄牛特异的I．7kb的杂交带。分析200bp的PCR扩增片段是牛的SRY基因片段。用同一对引物扩增人和山羊的DNA样品,也获得雄性特异的200bp的扩增片段。     

采用苯酚羟化酶基因特异引物检测苯酚降解菌

根据苯酚羟化酶基因高度保守序列设计了一对该基因的特异PCR引物。采用该特异引物从苯酚降解菌醋酸钙不动杆菌 (Acinetobactercalcoaceticus)PHEA 2的总DNA中扩增到唯一一条大小为 684bp的片段。该DNA片段与已知的A .calcoaceticusNCIB82 50的苯酚羟化酶基因具有高度的同源性 ,其核苷酸序列的同源性为 84% ,推导的氨基酸序列的同源性为 98%。对苯酚和非苯酚降解菌株的PCR扩增结果表明 :所有苯酚降解菌均能扩增出 684bp的特征片段 ,而非苯酚降解菌则无PCR条带。对炼焦废水中的细菌群落进行PCR扩增和生化特性检测表明 :显示 684bp特征片段的菌株均具有苯酚降解特性。上述结果表明 ,利用苯酚羟化酶基因的特异引物可对环境中的苯酚降解菌株进行准确快速的PCR检测。     

甜樱桃(Prunus avium L.)品种S基因型鉴定

根据蔷薇科S-RNase基因(S基因)高度保守区C2和RC4区设计一对特异引物PruC2和PruC4R,对甜樱桃品种的基因组DNA进行S基因特异PCR扩增。克隆S基因的扩增片段,核酸序列在GenBank上搜索,确定了4种S基因的核酸序列和大小。结果表明,在琼脂糖凝胶上位置相同的扩增带其核酸序列相同,是同一种S基因。4种S基因扩增片段的大小分别是：S1为677bp,S3为762bp,S4为945bp,S6为456bp。参试的自交不亲和品种的S基因型分别是：红灯、红艳、早红宝石和先锋相同,为S1S3;抉择、红丰和那翁相同,为S3S4;大紫为S1S6;长把红为S1S4;养老为S2S6;自交亲和品种外引7号和斯太拉为S3S4。     

核糖体基因ITS作为苎麻疫霉、恶疫霉分类辅助性状的研究

以2个雄器大多围生、少数侧生的苎麻疫霉菌株与1个雄器侧生、偶有围生的恶疫霉菌株为材料,采用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物,PCR扩增3个供试菌株核糖体基因的ITS1和ITS2,并对PCR产物进行了克隆和序列分析。结果是苎麻疫霉的ITS1和ITS2分别由206和453个碱基组成,而恶疫霉则分别由218和415个碱基组成。2个供试苎麻疫霉菌株的ITS1和ITS2的碱基序列同源性均分别为100%。苎麻疫霉和恶疫霉ITS1同源性为74.9%,其中中间区域40bp-164bp之间在两种间变异丰富,同源性只有59.4%,而1bp-39bp和165bp-239bp两区域的同源性分别为92.3%和92.1%;ITS2在两种疫霉菌间的同源性为71.0%。结果表明苎麻疫霉和恶疫霉ITS的碱基序列有明显差异。上述结果提示,ITS区域碱基序列可区分苎麻疫霉和恶疫霉。     

核糖体基因ITS作为苎麻疫霉、恶疫霉分类辅助性状的研究*

以2个雄器大多围生、少数侧生的苎麻疫霉菌株与1个雄器侧生、偶有围生的恶疫霉菌株为材料,采用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物,PCR扩增3个供试菌株核糖体基因的ITS1和ITS2,并对PCR产物进行了克隆和序列分析。结果是苎麻疫霉的ITS1和ITS2分别由206和453个碱基组成, 而恶疫霉则分别由218和415个碱基组成。2个供试苎麻疫霉菌株的ITS1和ITS2的碱基序列同源性均分别为100%。苎麻疫霉和恶疫霉ITS1同源性为74.9%,其中中间区域40bp-164bp之间在两种间变异丰富,同源性只有59.4%,而1bp-39bp和165bp-239bp两区域的同源性分别为92.3%和92.1%; ITS2在两种疫霉菌间的同源性为71.0%。结果表明苎麻疫霉和恶疫霉ITS的碱基序列有明显差异。上述结果提示,ITS区域碱基序列可区分苎麻疫霉和恶疫霉。     

串珠镰孢霉D-泛解酸内酯水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用D_泛解酸内酯水解酶N末端序列,并根据NCBI中公布的D_泛解酸内酯水解酶cDNA序列设计了一个特异引物,该引物结合Oligo(dT) 1 5,以串珠镰孢霉(Fusariummoniliforme)CGMCC 0 5 36mRNA反转录得到的总cDNA为模板进行扩增,获得约1 5kb左右的片段,将其克隆到T载体上进行测序,对测得的序列进行分析,重新设计了一对引物,并在引物两端分别加上限制酶EcoRⅠ和SalⅠ的识别位点序列,利用热启动PCR成功地扩增出了D_泛解酸内酯水解酶基因,基因片段长度为114 6bp ,该序列同来源于尖镰孢霉菌(F .oxysporum)AKU 370 2菌株的编码D_泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因的同源性为90 0 6 %。将所得片段定向克隆到pTrc99a载体中,转化至JM10 9感受态细胞,筛选出了阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,进行SDS_PAGE电泳,检测出在约4 0kD处有一蛋白表达带。对两株重组基因工程菌的比活力进行测定,结果分别为37U和4 1U。     

苎麻细胞质雄性不育“三系”ISSR 特异片段克隆和序列分析

利用ISSR 分子标记技术对苎麻细胞质雄性不育“三系”mtDNA 进行多态性分析; 在选用的38 个ISSR引物中, 有6 个引物的扩增产物在不育系、保持系和恢复系之间存在差异。对这些特异性片段进行克隆和序列测定, 结果表明: 片段21-MS 全长956 bp , 包含一个525 bp 的完整编码区, 共编码174 个氨基酸。片段31-M􊄯R 全长778 bp , 包含一个404 bp 的不完整编码区, 共编码134 个氨基酸; 其核苷酸和氨基酸序列与已报道的多种植物中的番茄红素β-环化酶基因分别存在71%～76%和73%～77%的同源性。     

编码嗜麦芽黄单胞菌terminase-like蛋白基因的克隆与分析

根据Grover报道的XanthomonasmaltophiliaCG类受体的 342bp核酸序列设计的一特异引物P2和随机引物进行PCR扩增 ,将约 75 0bpPCR产物克隆到 pUCm T载体上 ,得到重组质粒 pUCm Ter。pUCm Ter上插入片段经M 13通用引物双向测序 ,其中ORF5 5 5核酸序列的 2 83～ 36 2bp部分与PseudomonasphageD3orf2基因的 1385～ 14 6 4bp部分有 86 %相同碱基。由ORF5 5 5编码 184aa蛋白序列的 1～ 16 5aa部分与PseudomonasphageD3orf2基因编码terminase的 2 2 9～ 393aa部分具有 6 6 %相同序列。因此 ,克隆到的ORF5 5 5核酸序列可能是编码嗜麦芽黄单胞菌terminase like蛋白的基因序列。     

牛β-酪蛋白5′端上游调控序列的克隆和序列分析

该文用PCR扩增了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列,并对其进行了克隆和序列分析。采集成年母牛肝,提取DNA。在牛β－酪蛋白基因外显子1和上游调控区内设计引物,扩增其上游调控序列。两条引物长均为19个核苷酸,引物间跨度为635bp。以牛肝DNA为模板,进行PCR扩增,扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳,可见特异的目的条带。从凝胶中回收目的片段,克隆到pGEM－T载体中。重组质粒提取DNA,进行序列分析。测序结果与文献发表的类似序列相比,仅有4个碱基不同,同源性达99．4％。表明获得了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列的克隆。     

利用长引物嵌套式反向PCR方法克隆雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列

用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ分别对雅致枝霉As32806基因组DNA进行消化,而后在低浓度条件下利用T4DNA连接酶使DNA自身环化。根据已知基因序列,设计一对长度为35nt的长反向引物和两对较短的引物,以基因组连接产物为模板,通过三轮嵌套式PCR反应,获得一长度约为4kb的扩增片段。经序列测定表明得到了Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因上游序列约为1.3kb,初步序列分析显示该序列为一潜在的启动子序列。     

反向PCR方法克隆腾冲嗜酸两面菌的分子伴侣基因*

根据已知的Sulfolobus属的分子伴侣基因,设计简并引物,用PCR的方法从腾冲嗜酸两面菌(Acidianus tengchongensis)基因组DNA中分别克隆到了分子伴侣α亚基和β亚基的约500bp的基因片段。以它们为探针进行Southern杂交,确定了合适的限制性内切酶。以确定的限制性内切酶消化的基因组DNA环化物为模板,进行反向PCR反应,引物的延伸方向由已知序列出发沿环化分子向未知区域进行,扩增产物经测序表明为α亚基和β亚基基因。根据所得序列分别设计两对引物进行PCR,测序结果     

高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆、结构分析及其功能的研究

从高山被孢霉ATCC1 62 66总DNA中扩增出大小为 1 374bp和 1 947bp的两条特异片段 ,序列分析表明后者在细胞色素b5和组氨酸Ⅰ之间含有一大小为 5 73bp的内含子和两条分别为 1 97bp和 82 8bp的外显子。推导的氨基酸二级结构分析表明 ,该基因有两个长的跨膜疏水区和 3个组氨酸保守区。分别根据D6D内含子及组氨酸Ⅱ区、Ⅲ区的序列设计引物 ,制备不同的探针与高山被孢霉的基因组杂交 ,证明在其基因组中确实存在两个Δ6 脂肪酸脱氢酶基因 ,其中一个基因含有内含子。把不含有内含子的核基因MAGL6 1克隆到的酿酒酵母表达载体pYES2 0中 ,转化到酿酒酵母INVSc1中。对筛选得到的酵母工程菌株进行脂肪酸GC分析 ,检测到了γ 亚麻酸 ,说明克隆的D6D基因MAGL6 1能在酿酒酵母中进行功能性表达。     

高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆、结构分析及其功能的研究

从高山被孢霉ATCC16266总DNA中扩增出大小为1374bp和1947bp的两条特异片段,序列分析表明后者在细胞色素b5和组氨酸Ⅰ之间含有一大小为573bp的内含子和两条分别为197bp和828bp的外显子。推导的氨基酸二级结构分析表明,该基因有两个长的跨膜疏水区和3个组氨酸保守区。分别根据D6D内含子及组氨酸Ⅱ区、Ⅲ区的序列设计引物,制备不同的探针与高山被孢霉的基因组杂交,证明在其基因组中确实存在两个Δ6脂肪酸脱氢酶基因,其中一个基因含有内含子。把不含有内含子的核基因MAGL61克隆到的酿酒酵母表达载体pYES20中,转化到酿酒酵母INVSc1中。对筛选得到的酵母工程菌株进行脂肪酸GC分析,检测到了γ亚麻酸,说明克隆的D6D基因MAGL61能在酿酒酵母中进行功能性表达。     

中国牛朊病毒基因的克隆和序列分析

从中国牛外周血中分离淋巴细胞,提取基因组DNA.用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出不致病的朊病毒蛋白(PrP~c)基因,并克隆到pGEM-Teasy Vector.序列分析表明所克隆的牛PrP~c的片段大小为795bp,包含了牛朊病毒基因的完整编码区序列.该基因无内含子,同国外报道的已知序列完全相同.     

高山被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆、结构分析及其功能的研究

从高山被孢霉ATCC16266总DNA中扩增出大小为1374bp和1947bp的两条特异片段,序列分析表明后者在细胞色素b5和组氨酸Ⅰ之间含有一大小为573bp的内含子和两条分别为197bp和828bp的外显子,推导的氨基酸二级结构分析表明,该基因有两个长的跨膜疏水区和3个组氨酸保守区,分别根据D6D内含子及组氨酸Ⅱ区,Ⅲ区的序列设计引物,制备不同的探针与高山被孢霉的基因组杂交,证明在其基因组中确实存在两个△^6-脂肪酸脱氢酶基因,其中一个基因含有内含子,把不含有内含子的核基因MAGL6-1克隆到的酿酒酵母表达载体pYES2.0中,转化到酿酒酵母INVSc1中,对筛选得到的酵母工程菌株进行脂肪酸GC分析,检测到了γ-亚麻酸,说明克隆的D6D基因MAGL6-1能在酿酒酵母中进行功能性表达。     

不同葡萄品种CBF1基因的克隆及序列分析

根据欧洲葡萄CBF1基因序列设计1对特异引物,采用PCR方法从山葡萄、贝达、SO4、Ln33和黑比诺的基因组中各扩增出1个DNA片段并克隆到pMD18-T栽体中.经序列测定和分析,各片段均长756 bp,与欧洲葡萄CBF1基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列分别具有98％和99％的同源性,而且推导的氨基酸序列中包含有同源性更高的AP2/EREBP DNA结合域,以及CBFs蛋白的两段特征序列(PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR).结果表明从5种葡萄中均可以克隆出CBF1基因.     

TT型病毒基因组的克隆与进化分析

利用PCR方法从输血传播性病毒 (transfusiontransmittedvirus,TTV)阳性标本中获得不同长度且重叠覆盖TTV基因组的DNA片段。将PCR扩增片段克隆到pT Adv载体中 ,筛选获得阳性克隆。DNA序列测定结果表明所克隆的片段为TTV基因组序列。利用DNA片段中特有的限制性内切酶位点将TTV的DNA片段首尾相连 ,得到近全长的基因组克隆 ,命名为TTV0 2 1。对TTV0 2 1的核酸序列进行分析 ,TTV0 2 1长 3472nt,存在 2个阅读框架ORF1和ORF2 ,分别编码 785和 1 46个氨基酸。将TTV0 2 1与其它已知的TTV基因组全序列进行了同源性比较 ,并进行进化分析。结果表明 ,TTV0 2 1序列与TTV分离株CHN2、BDH1的遗传距离较近 ,而与其它分离株相对较远。     

八肋游仆虫第二类释放因子基因的克隆与序列分析

分离八肋游仆虫 (Euplotesoctocarinatus)大核eRF3基因 ,为进一步研究第二类释放因子结构与功能 ,探讨低等真核生物新生肽链释放机理提供实验素材 .以八肋游仆虫基因组DNA为材料 ,根据已知的第二类释放因子eRF3保守氨基酸序列设计引物 ,扩增克隆了该游仆虫的第二类释放因子基因片段 ,并对其核苷酸序列进行了分析 .根据测得的序列设计特异性引物 ,并利用游仆虫的端粒序列 (C4 A4 C4 A4 C4 A4 C4 )为引物 ,扩增得到该基因的全序列 .序列分析表明 ,该基因位于 2 782bp长的大核染色体上 ,编码区由 2 4 0 0bp组成 ,编码 80 0个氨基酸 ,不含内含子