生物信息学研究新基因LRP15

为了利用生物信息学探索网上克隆基因与预测基因功能的新方法,首先用一段1.8kbDNA片段的人类EST数据库中进行电子杂交并对相互重叠的EST片段组装,通过引物设计进行cDNA末端快速扩增,以高通量基因组序列（HTGS）数据库及SAGE库为基础,进行染色体定位及组织表达分析。通过DAS及RPS－BLAST程序预测其蛋白质结构及功能。结果显示,LRP15 cDNA全长1718bp,含一个780bp的开放读码框架,编码259个氨工酸,该基因定位于染色体3p24,在多种组织中表达。其编码蛋白含有N端富含亮氨酸重复序列及潜在的穿膜序列。研究表明,生物信息学是克隆与预测基因功能的有效方法;LRP15基因可能是一个参与细胞发育调控的新基因。     

LRP4与人类罕见遗传病

低密度脂蛋白受体相关蛋白4(low-density lipoprotein receptor-related protein 4,LRP4)在2010年被报道确认为CLS型并指综合征(Cenani-Lenz syndactyly syndrome)的致病基因,相继有文献报道了LRP4的突变会造成17型先天性肌无力症(myasthenic syndrome,congenital 17)和二型硬化性骨病(sclerosteosis 2)。LRP4参与调节经典WNT信号通路和MAPK/JNK信号通路,在神经肌肉接头中与MUSK/AGRIN组成复合物,调节突触后转化。LRP4参与肢端、神经肌肉接头、肾脏、乳腺和牙齿的发育形成,参与骨代谢进程。现将重点介绍LRP4在人类中所引起的3种单基因疾病和从遗传发育角度综述目前关于LRP4的研究进展,对未来深入研究LRP4在脊椎动物早期发育中的功能机制提供一定的参考。     

LRP16基因启动子克隆及特征分析

克隆LRP16基因启动子分子,并对启动子特征进行分析,预测启动子区调控元件,为深入研究LRP16基因的表达调控机制奠定基础。在NCBI的人类基因组数据库中截取并下载LRP16基因转录起始位点5′侧翼区2.7kb的基因组序列,设计PCR引物,从健康外周血单个核细胞中扩增,利用Genomatix程序对5′侧翼区近1000bp进行启动子特征分析,获得了与GenBank序列一致,长度为2.7kb的LRP16基因启动子DNA序列,该序列具有典型的真核生物RNA聚合酶Ⅱ启动子特征及多个核受体结合位点,如α视黄酸受体及RAR相关孤生受体。     

LRP16短发夹RNA慢病毒载体的构建及LRP16稳定抑制细胞的建立

目的:构建靶向LRP16基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,鉴定其在HeLa细胞中对LRP16的抑制效果。方法:构建pWPT-U6-LRP16shRNA-CMV-GFP慢病毒载体,通过病毒感染、细胞筛选、Western印迹等步骤,获得LRP16基因稳定抑制的细胞株。结果:构建了具有LRP16干扰效果的慢病毒载体,感染HeLa细胞后获得了稳定沉默LRP16及对照的细胞株;经克隆筛选,在荧光显微镜下观察到近似100%感染细胞发出绿色荧光;Western印迹证实pWPT-U6-L374-CMV-GFP和pWPT-U6-L668-CMV-GFP均可显著抑制HeLa细胞株中LRP16蛋白的表达,其中pWPT-Gsi-L374-GFP的抑制效果更好。结论:构建了靶向人LRP16基因shRNA慢病毒载体及LRP16稳定抑制的HeLa细胞系。     

LRP16基因启动子顺式调控元件分析

为分析LRP16基因启动子区顺式调控元件,为深入研究LRP16基因的表达调控机制奠定基础。首先在NCBI的人类基因组数据库中截取并下载LRP16基因转录起始位点5’侧翼区2．6kb的基因组序列,设计PCR引物,从健康外周血单个核细胞中扩增LRP16基因的启动子分子;然后构建包含长度为2．6kb的LRP16基因启动子分子的pG13-LRP16启动子荧光素酶报道重组子,转染入Hela细胞后检测荧光素酶活性;最后利用Genomatix MatInspector Release professional 5．3、RSA—tools和TESS3个启动子顺式调控元件数据库对LRP16基因启动子进行分析。结果表明LRP16基因启动子DNA序列具有真核启动子活性,该区域既有通用启动子结构,又具有与肿瘤发生、细胞周期调控和急性反应期蛋白有关的顺式调控元件,包括：Spl、T—Ag、ZF5、CAC盒、PU．1、c—Ets、XPF-1、IL-6受体、雌激素受体和视黄醇受体。     

LRP16对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

用Northern印迹方法检测雌二醇 (17β E2 )对LRP16mRNA表达的时间及剂量依赖性调控作用 .构建LRP16基因启动子序列调控的萤光素酶报告子 (pS0 ) ,并与雌激素受体α和 β(ERα和ERβ)表达载体共转染COS 7和MCF 7细胞后测定萤光素酶活性 .将LRP16基因的表达载体转染MCF 7细胞 ,测定过表达LRP16对细胞的生长特性的影响 .17β E2 使MCF 7细胞中LRP16mRNA表达水平增加 ,增加幅度未显示出 17β E2 培养时间和剂量的依赖性 .pS0 与ERα表达载体共转染细胞的相对萤光素酶活性较非共转染组 (对照组 )及pS0 ERβ表载体共转染组升高 5～ 10倍 .LRP16基因过表达促进MCF 7细胞的增殖 .研究表明 ,雌激素可能通过ERα上调乳腺癌MCF 7细胞LRP16基因的表达并促进细胞增殖     

家兔肝脏LRP蛋白的分离纯化与鉴定

利用家兔LRP蛋白聚集形成蛋白复合物的性质,首先通过两次蔗糖密度梯度离心从家兔肝脏中分离得到LRP粗提液,再利用分子大小差异,使用Sephacryl-1000分子筛层析纯化,SDS-PAGE银染结果显示最终得到了单一电泳条带的家兔LRP蛋白.最后使用LRP单克隆抗体的Western blotting鉴定结果正确.     

LRP16影响电离辐射诱导的NF-κB活性

目的:研究LRP16在电离辐射激活核转录因子NF-κB信号转导通路中的作用。方法:在HeLa细胞中,分别运用双萤光素酶分析和Western印迹检测LRP16对κB-Luc报告基因及NF-κB下游靶基因表达的影响。结果:双萤光素酶实验证实LRP16过表达促进电离辐射诱导的κB-Luc活性,而抑制LRP16则降低电离辐射诱导的κB-Luc活性;Western印迹结果显示,LRP16过表达促进电离辐射诱导NF-κB的下游抗凋亡基因XIAP的表达,与之相对应的是,抑制LRP16降低电离辐射诱导NF-κB下游抗凋亡基因XIAP的表达。结论:LRP16可以调节电离辐射诱导NF-κB的转录活性,并且调控NF-κB下游抗凋亡基因XIAP的表达,为进一步阐明电离辐射激活NF-κB转录活性的分子机制奠定了基础。     

Identification of LRP1B-interacting proteins and inhibition of protein kinase Cα-phosphorylation of LRP1B by association with PICK1

Recent studies show LDL receptor-related protein 1B, LRP1B as a transducer of extracellular signals. Here, we identify six interacting partners of the LRP1B cytoplasmic region by yeast two-hybrid screen and confirmed their in vivo binding by immunoprecipitation. One of the partners, PICK1 recognizes the C-terminus of LRP1B and LRP1. The cytoplasmic domains of LRP1B are phosphorylated by PKCα about 100 times more efficiently than LRP1. Binding of PICK1 inhibits phosphorylation of LRP1B, but does not affect LRP1 phosphorylation.This study presents the possibility that LRP1B participates in signal transduction which PICK1 may regulate by inhibiting PKCα phosphorylation of LRP1B.

Structured summary

MINT-6801075: Lrp1b (uniprotkb:Q9JI18) physically interacts (MI:0218) with SNTG2 (uniprotkb:Q925E0) by two hybrid (MI:0018)MINT-6801030, MINT-6801468: Lrp1b (uniprotkb:Q9JI18) physically interacts (MI:0218) with Pick1 (uniprotkb:Q80VC8) by two hybrid (MI:0018)MINT-6801284: LRP1B4 (uniprotkb:Q9JI18) physically interacts (MI:0218) with RanBPM (uniprotkb:P69566) by anti tag coimmunoprecipitation (MI:0007)MINT-6801108: Lrp1b (uniprotkb:Q9JI18) physically interacts (MI:0218) with Grb7 (uniprotkb:Q03160) by two hybrid (MI:0018)MINT-6801090: Lrp1b (uniprotkb:Q9JI18) physically interacts (MI:0218) with RanBPM (uniprotkb:P69566) by two hybrid (MI:0018)MINT-6801008: Lrp1b (uniprotkb:Q9JI18) physically interacts (MI:0218) with Jip-1b (uniprotkb:Q9WVI9-1) by two hybrid (MI:0018)MINT-6801052: Lrp1b (uniprotkb:Q9JI18) physically interacts (MI:0218) with Jip-2 (uniprotkb:Q9ERE9) by two hybrid (MI:0018)MINT-6801258, MINT-6801271: LRP1B4 (uniprotkb:Q9JI18) physically interacts (MI:0218) with Pick1 (uniprotkb:Q80VC8) by anti tag coimmunoprecipitation (MI:0007)MINT-6801244: RanBPM (uniprotkb:P69566) physically interacts (MI:0218) with mLRP4 (uniprotkb:Q8VI56) by anti tag coimmunoprecipitation (MI:0007)MINT-6801131, MINT-6801158: LRP1B4 (uniprotkb:Q9JI18) physically interacts (MI:0218) with Jip-1b (uniprotkb:Q9WVI9-1) by anti tag coimmunoprecipitation (MI:0007)MINT-6801231: PICK1 (uniprotkb:Q80VC8) physically interacts (MI:0218) with mLRP4 (uniprotkb:Q8VI56) by anti tag coimmunoprecipitation (MI:0007)MINT-6801173: Jip-1b (uniprotkb:Q9WVI9-1) physically interacts (MI:0218) with mLRP4 (uniprotkb:Q8VI56) by anti tag coimmunoprecipitation (MI:0007)     

家族性渗出性玻璃体视网膜病变患者LRP5基因突变研究

家族性渗出性玻璃体视网膜病变(familial exudative vitreoretinopathy, FEVR)是一种遗传性眼科疾病,主要特征为视网膜周边血管发育异常和病变。由于病变程度不同,临床表型可从无明显症状到眼睛完全失明。本文通过研究3个中国FEVR家系和1个散发型患者,探索其致病突变与疾病表型之间的关系。收集家系中患者及亲属的外周血制备基因组DNA,设计引物以扩增FEVR致病基因FZD4、LRP5、NDP和TSPAN12的外显子区域并通过Sanger法进行测序。结果发现,在LRP5基因上存在3个未在dbSNP数据库及千人基因组计划数据库中报道过的杂合突变p.M181R、p.R399S和p.G503R,以及2个已发现但未在FEVR中报道过的杂合突变p.R494Q和p.G876S。生物信息学分析表明这5个突变位点均高度保守,为有害突变。荧光素酶报告基因实验证明了这5个突变均不能激活Norrin/β-catenin信号通路,进一步证明了这5个突变的致病性。该研究扩充了我国FEVR疾病的遗传数据库,可为该疾病的分子诊断提供依据。     

LRP16影响宫颈癌Siha细胞对化疗药物的敏感性

目的:探讨抑制LRP16的表达对宫颈癌Siha细胞的化疗药物敏感性的影响。方法:将抑制LRP16表达的小干扰RNA:negativecontrol-si RNA(NC)、si RNA-374(si374)转染入Siha宫颈鳞癌细胞系中,通过顺铂(DDP)和紫杉醇(TAX)的处理后,采用CCK-8检测不同浓度紫杉醇、顺铂作用宫颈癌细胞系Siha48 h后,计算出细胞被抑制一半时顺铂、紫杉醇的药物浓度(IC50);使用Hoechst33342染色观察细胞凋亡,采用流式细胞仪检测顺铂IC50作用Siha细胞48小时后的细胞凋亡情况,紫杉醇IC50作用Siha细胞之后的细胞周期分布情况。结果:CCK-8检测转染的Siha细胞增殖活性受到抑制,Hoechst33342染色观察转染的Siha细胞凋亡明显增加,流式细胞仪检测凋亡显示,si374+顺铂的早期凋亡率22.15±2.24,NC+顺铂12.45±2.72,流式细胞仪检测周期显示G2/M(%),si374+紫杉醇29.94±1.87,NC+紫杉醇17.66±2.32。结论:LRP16基因表达下调之后,抑制Siha细胞的增殖、促进其凋亡,使细胞周期滞留于G2/M期,从而提高Siha细胞的化疗敏感性。     

Reconstitution of a Frizzled8��Wnt3a��LRP6 Signaling Complex Reveals Multiple Wnt and Dkk1 Binding Sites on LRP6

Wnt/β-catenin signaling is initiated at the cell surface by association of secreted Wnt with its receptors Frizzled (Fz) and low density lipoprotein receptor-related protein 5/6 (LRP5/6). The study of these molecular interactions has been a significant technical challenge because the proteins have been inaccessible in sufficient purity and quantity. In this report we describe insect cell expression and purification of soluble mouse Fz8 cysteine-rich domain and human LRP6 extracellular domain and show that they inhibit Wnt/β-catenin signaling in cellular assays. We determine the binding affinities of Wnts and Dickkopf 1 (Dkk1) to the relevant co-receptors and reconstitute in vitro the Fz8 CRD·Wnt3a·LRP6 signaling complex. Using purified fragments of LRP6, we further show that Wnt3a binds to a region including only the third and fourth β-propeller domains of LRP6 (E3E4). Surprisingly, we find that Wnt9b binds to a different part of the LRP6 extracellular domain, E1E2, and we demonstrate that Wnt3a and Wnt9b can bind to LRP6 simultaneously. Dkk1 binds to both E1E2 and E3E4 fragments and competes with both Wnt3a and Wnt9b for binding to LRP6. The existence of multiple, independent Wnt binding sites on the LRP6 co-receptor suggests new possibilities for the architecture of Wnt signaling complexes and a model for broad-spectrum inhibition of Wnt/β-catenin signaling by Dkk1.     

应用RNAi技术沉默大转录本基因LRP1B

低密度脂蛋白受体相关蛋白1B(Lipoprotein receptor-related protein 1 B, LRP1B)是脂蛋白受体家族庞大受体亚群的成员之一, LRP1B基因编码一个长达16.5 kb的大转录本。由于LRP1B的转录产物过大限制了其功能研究。为研究LRP1B基因与肿瘤转移的相关性, 文章应用RNAi技术特异地封闭了LRP1B基因的表达。在设计siRNA过程中, 根据高效siRNA序列特征和靶序列处的mRNA二级结构特点, 对LRP1B基因多达1 100个的siRNA候选靶序列进行双重评价, 最终在基因转录本的不同位置选取了6个siRNA靶位点。针对这些靶位点, 文章构建了6个表达shRNA的pSilencer4.1重组体, 稳定转染HEK 293细胞并采用半定量RT-PCR检测各表达载体的沉默效果。结果表明, 所构建的6个shRNA-pSilencer4.1重组体中有5个对LRP1B基因形成了有效沉默(＞50%), 并得到了多个完全封闭LRP1B基因表达的HEK 293细胞单克隆。     

LRP16结合poly(ADP-ribose)关键位点的识别

LRP16作为macro domain 家族成员,可识别、结合poly(ADP-ribose),参与DNA损伤修复的早期反应. 但究竟LRP16通过其何种氨基酸位点识别、结合poly(ADP ribose)（PAR）尚不十分清楚．本研究首先通过对LRP16蛋白的结构分析,查找LRP16结合PAR的候选氨基酸位点,然后利用丙氨酸扫描技术构建系列LRP16（点）突变体, 并且进行原核蛋白表达与纯化,将获得的蛋白质进行斑点杂交实验,检测LRP16突变体蛋白与PAR的结合活性.测序结果显示,LRP16点突变基因序列成功插入到原核表达载体pGEX-6p-1中|斑点杂交实验显示,LRP16中第160位D和第161位I突变成A后,其与PAR结合能力明显减弱,而第181位G、183位V、184位D同时突变为A,LRP16与PAR的结合活性有部分减弱. 结果表明,LRP16中第160位和第161位的氨基酸是其与PAR结合的关键位点.     

LRP16短发夹RNA慢病毒载体的构建及LRP16稳定抑制细胞的建立简

目的：构建靶向LRPl6基因的短发夹RNA（shRNA）慢病毒表达载体,鉴定其在HeLa细胞中对LRP16的抑制效果。方法：构建pWPT-U6-LRPl6shRNA-CMV-GFP慢病毒载体,通过病毒感染、细胞筛选、Western印迹等步骤,获得LRP16基因稳定抑制的细胞株。结果：构建了具有LRP16干扰效果的慢病毒载体,感染HeLa细胞后获得了稳定沉默LRP16及对照的细胞株;经克隆筛选,在荧光显微镜下观察到近似100％感染细胞发出绿色荧光;Western印迹证实pWPT-U6-L374-CMV-GFP和pWPT-U6-L668-CMV-GFP均可显著抑制HeLa细胞株中LRP16蛋白的表达,其中pWPT-Gsi-L374-GFP的抑制效果更好。结论：构建了靶向人LRP16基因shRNA慢病毒载体及LRP16稳定抑制的HeLa细胞系。     

Binding of α2ML1 to the Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 1 (LRP1) Reveals a New Role for LRP1 in the Human Epidermis

Background

The multifunctional receptor LRP1 has been shown to bind and internalize a large number of protein ligands with biological importance such as the pan-protease inhibitor α2-macroglobulin (α2M). We recently identified Α2ML1, a new member of the α2M gene family, expressed in epidermis. α2ML1 might contribute to the regulation of desquamation through its inhibitory activity towards proteases of the chymotrypsin family, notably KLK7. The expression of LRP1 in epidermis as well as its ability to internalize α2ML1 was investigated.

Methods and Principal Findings

In human epidermis, LRP1 is mainly expressed within the granular layer of the epidermis, which gathers the most differentiated keratinocytes, as shown by immunohistochemistry and immunofluorescence using two different antibodies. By using various experimental approaches, we show that the receptor binding domain of α2ML1 (RBDl) is specifically internalized into the macrophage-like cell line RAW and colocalizes with LRP1 upon internalization. Coimmunoprecipitation assays demonstrate that RBDl binds LRP1 at the cell surface. Addition of RAP, a universal inhibitor of ligand binding to LRP1, prevents RBDl binding at the cell surface as well as internalization into RAW cells. Silencing Lrp1 expression with specific siRNA strongly reduces RBDl internalization.

Conclusions and Significance

Keratinocytes of the upper differentiated layers of epidermis express LRP1 as well as α2ML1. Our study also reveals that α2ML1 is a new ligand for LRP1. Our findings are consistent with endocytosis by LRP1 of complexes formed between α2ML1 and proteases. LRP1 may thus control desquamation by regulating the biodisponibility of extracellular proteases.     

Macro Domain家族成员LRP16是多种核受体的相互作用因子

LRP16基因是macro domain家族成员之一,C末端含有唯一的1个保守的功能结构域. 既往研究表明,该基因具有雌激素反应性,并可通过与雌激素受体α （ERα）相互作用调控其转录活性.近期我研究组发现,LRP16可与雄激素受体（AR）的共激活因子ART-27相互作用.本研究首先通过GST pull-down方法验证LRP16/ART-27/AR三者之间相互作用关系,并用免疫共沉淀实验明确了LRP16与AR存在直接的相互作用,且这种相互作用并不依赖于ART-27的存在;采用GST pull-down进一步明确LRP16与AR相互作用的结构域.结果发现,LRP16通过C端的macro domain结构域与AR的LBD域相互作用;鉴于核受体家族有较高程度的氨基酸序列保守性与功能结构域的相似性,通过GST pull-down验证了LRP16与核受体超家族成员ERβ、GR、PPARα、PPARγ的相互作用,提示LRP16至少还可与ERα以外的5个核受体家族成员相互作用;进一步采用核受体荧光素酶报告基因转染细胞,通过检测荧光素酶活性证实LRP16可增强AR、GR、ERβ、PPARα、PPARγ的转录激活活性.本研究初步证实,macro domain家族成员LRP16可与多个核受体相互作用,并增强其转录激活活性,是核受体家族的共激活因子,为进一步研究LRP16在核受体转录调控中的生理病理学功能奠定基础.     

小干扰RNA抑制LRP16基因表达限制了MCF-7乳腺癌细胞增殖

雌激素雌二醇上调人乳腺癌细胞MCF 7中LRP16基因表达 ,该基因过表达促进MCF 7细胞增殖 .为进一步探讨LRP16基因不同表达水平对MCF 7细胞增殖的影响以及对雌激素的反应性增殖能力 ,采用针对LRP16基因特异的小干扰RNA策略 ,通过逆转录病毒介导及抗性筛选构建了LRP16基因被稳定抑制的 2个MCF 7细胞系 ,针对绿色荧光蛋白的干扰序列作为阴性对照 .Northern印迹实验检测了LRP16基因在各个细胞株中mNRA的水平 ,与对照组细胞比较 ,针对LRP16基因不同位置的 2个小干扰RNA可分别将该基因抑制 90 %和 6 0 % .细胞增殖试验结果显示 ,MCF 7细胞中LRP16基因表达抑制率越高 ,细胞增殖速率减慢越显著 (P <0 0 5 ) ;软琼脂集落形成试验结果显示 ,抑制LRP16基因在MCF 7细胞中表达 ,限制了细胞锚定非依赖性生长 ;细胞周期分析结果表明 ,LRP16基因抑表达使MCF 7细胞G1 S周期转换受抑 ;Western印迹结果表明 ,LRP16基因表达抑制的细胞中细胞周期蛋白E及细胞周期蛋白D1蛋白水平显著下调 ,但未检测到P5 3及Rb蛋白表达水平的影响 .雌二醇刺激的增殖实验结果显示 ,抑制LRP16基因表达没有消除MCF 7细胞的反应性增殖特征 .上述结果表明 ,LRP16基因表达量与MCF 7细胞增殖能力密切相关 ,抑制其表达可有效限制MCF 7细胞的增殖能力 ,提     

LRP、TOPO-II在非小细胞肺癌中的协同表达及其临床意义

目的 探讨肺耐药蛋白(lung resistance protein,LRP)和DNA拓扑异构酶Ⅱ(topoisomerase-Ⅱ,TOPO-Ⅱ)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的协同表达及其临床意义。方法 用SP免疫组化方法检测62例术前均未进行化疗的NSCLC组织中LRP、TOPO-Ⅱ蛋白的表达情况。结果 在NSCLC中LRP、TOPO-Ⅱ蛋白表达的阳性率分别为75.8％(47/62例);64.5％(40/62例)。LRP蛋白表达与分化程度相关。TOPO-Ⅱ蛋白表达与分化程度、有无淋巴结转移相关。LRP与TOPO-Ⅱ协同表达与生存率相关。结论 应用免疫组织化学方法检测NSCLC中LRP、TOPO-Ⅱ的表达对肿瘤的化疗药物选择和预后判断具有显的临床意义。     

ERα与Sp1相互作用激活LRP16启动子转录活性

根据已报道的LRP1 6启动子序列 (2 6kb) ,采用PCR反应获得 6个启动子 5′删除突变体 ,分别插入pGL3 Basic载体 ,构建 6种 5′缺失报告基因表达载体 (pS1 ～pS6) .分别与ERα真核表达载体共转染MCF 7细胞 .用双荧光素酶报告系统测定荧光素酶活性 ,以明确LRP1 6基因上游启动子区域中的雌激素反应序列 .结果显示 ,pS1 ～pS6均有雌二醇反应性 .进而对pS5的 3′端缺失分析发现LRP1 6基因翻译起始位点上游 - 2 1 4至 - 2 5 1位置的序列具有雌激素应答 ,序列分析发现该片段序列中包含了一个供转录因子Sp1结合的GC富含位点和一个ERα反应元件的半位点 (1 2ERE Sp1 ) ,进一步突变分析显示这两个元件均为雌激素反应性所必需 .以含这两个顺式元件的序列 (- 2 5 3bp至 - 2 2 4bp)作为探针 ,超级迁移凝胶电泳试验结果表明了ERα和Sp1蛋白均可以和探针结合 .研究发现了雌激素上调LRP1 6基因表达的一个增强子元件— 1 2ERE Sp1 ,ERα和Sp1蛋白需要与DNA结合形成复合体 ,通过其相互作用激活转录