兰州鲇精液超低温冷冻保存技术研究及细胞损伤检测

为保护兰州鲇(Silurus lanzhouensis Chen)种质资源,促进新品种选育,文章开展了兰州鲇精液超低温冻存抗冻剂筛选及程序保存技术研究,并通过精子解冻激活率、核DNA检测、扫描电镜和透射电镜检测技术对冻存效果和冻存损伤情况进行了评测。结果表明:兰州鲇精液以10%DMSO为抗冻剂, 4℃平衡20min,–80℃平衡30min后立即置于液氮超低温保存,并于40℃水浴解冻时精子冻存效果较佳,冻精激活率达(75.56±3.91)%。SCGE检测DNA损伤结果显示超低温冻存10d、20d及30d兰州鲇精液的彗星率和损伤系数无显著差异。扫描电镜检测显示兰州鲇精子明显分头部,中段及尾部3部分,属于单鞭毛型,无顶体,无侧鳍,中心粒相互垂直呈\"T\"形,鞭毛为典型的\"9+2\"微管结构。冻存结构损伤主要表现为膜损伤,细胞质膜与染色质膜发生破损、折皱、囊泡化或整体脱落,细胞核膜与质膜空隙加大,核发生变形,核质疏散,线粒体结构弥散,线粒体内容物外流,中心粒复合体易位,鞭毛外膜变形脱离,中段位置断裂,微管结构基本完好。研究筛选的超低温冷冻保存技术可长期有效保存兰州鲇精液,为兰州鲇种质资源保护及今后...     

大熊猫精液超低温冷冻的比较

对卧龙自然保护区大熊猫研究中心的9只雄性大熊猫电刺激采精,比较研究了稀释液中甘油含量、精液离心、不同稀释液和冷冻方法对大熊猫精液超低温冷冻保存后的活力、运动状态和顶体的影响。稀释液中甘油的含量为4％－5％较好,冻精解冻后的活力和顶体的正常率能保持鲜精的一半。离心和未离心的精液经超低温冷冻,解冻后的活力和运动状态都较接近。TEST和SFS两种稀释液的效果没有明显的差异。细管的冷冻过程较颗粒方便、快捷,时间容易控制,是一种较好的超低温冷冻精液的方法。     

中国花鲈精子的超低温冷冻保存及酶活性检测

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超低温冷冻对黄鳝精子中几种酶活性的影响

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动物种质细胞的超低温冷冻保存

目前不少种类的动物种质细胞都可在超低温条件下保存,随着低温生物学和生殖生物学的不断发展,超低温保存技术也在不断发展,可以保存的动物种质细胞范围也在不断扩大。但目前超低温保存技术面临的困难和需要解决的问题是如何提高种质细胞冷冻保存的效果,寻求最佳冷冻方案,降低种质细胞的冷冻损伤,进而运用超低温冷冻技术保护物种的多样性。从目前的研究情况来看,动物种质细胞超低温保存的常用方法有程序降温法和玻璃化法。防冻     

黄鳝精液-80℃超低温冷冻保存试验

采用-80℃超低温冷冻方法对黄鳝精液冷冻保存技术进行了研究.获得如下结果:黄鳝精子在冻存前不需低温平衡过程;10%DMSO作为抗冻保护剂效果最好,以200 μL离心管为冻存容器,保存168 h,精子相对活力可达79%;以细管为冻存容器,精子相对活力可达88%.此结果为黄鳝精子冷冻保存库的建立提供了实验依据.     

圈养黑熊精液的冷冻保存

将采自23 头成年圈养黑熊的精液,分别用3 种稀释液(Ⅰ:Tris - 乳- 果- 卵;Ⅱ:柠- 葡- 蔗- 卵;Ⅲ:Tris - 柠- 果- 葡- 卵)稀释并在4℃ 下保存,通过检测精液在不同稀释液稀释条件下的保存时间,筛选出最适稀释液用于精液的冷冻保存;从精液解冻后精子的活率、活力、畸形率、顶体完整率4 个指标,分别从3种冷冻保护剂(甘油3%、3.5% 、4% )、两种冷冻方法(两步冷冻法和自动冷冻法)两个方面进行了比较试验。结果表明:精子活力在0.3 以上时,稀释液Ⅲ保存时间为175.42 ± 3.04 h,显著高于稀释液Ⅰ和稀释液Ⅱ(P ﹤0.01),稀释液Ⅱ保存时间也明显高于稀释液Ⅰ (P ﹤0.01);含3.5% 甘油浓度的稀释液解冻后精子活率(41.75 ± 3.46% )、活力(32.63 ±5.27% )和顶体完整率(85.62 ± 4.58% )显著高于其他两组(P ﹤0.01),并且精子畸形率(29.32 ± 8.22% )明显低于其他两组(35.95 ± 8.04% ,36.07 ±7.72% )(P ﹤0.01);采用自动冷冻法冷冻保存圈养黑熊精液,解冻后精子活率、活力和顶体完整率分别为41.75 ±3.46% 、32.63 ± 5.27%和85.62 ±4.58% ,都明显高于两步冷冻法(P ﹤0.01);解冻后畸形率为29.32 ± 8.22% ,明显低于两步冷冻法(P ﹤0.01)。     

α-酮戊二酸对奶山羊精液冷冻保存及精子受精能力的影响

本研究旨在探究α-酮戊二酸(alpha-ketoglutaric acid, AKG)对奶山羊精液冷冻保存效果的影响,并深入揭示其潜在的作用机制。选取10只健康萨能奶山羊种公羊,采集并混合活率大于80%的精液。将精液与含有不同浓度AKG (0、10、100、1 000 μg/mL)的冷冻液混合,采用液氮熏蒸法进行冷冻保存。解冻后分别检测精子运动参数、生存指数、质膜完整率、顶体完整率、抗氧化酶活性、ATP水平及凋亡发生率等关键指标。基于上述结果筛选出最佳浓度,并利用非靶向代谢组学技术分析其引起的代谢物与代谢通路变化。最后,通过体外受精和人工授精试验,对冷冻精液的受精能力进行综合评价。结果表明,与对照组相比,添加100 μg/mL AKG显著提升了冷冻-解冻后精子质量,其精子活力达到58.71%,质膜与顶体完整率分别显著提高至61.56%和62.49%。同时,该浓度的AKG显著提高了精子的总抗氧化能力、过氧化氢酶及超氧化物歧化酶活性,同时显著降低了丙二醛和活性氧水平。此外,精子内ATP水平显著升高,而早期凋亡发生率显著降低。非靶向代谢组学分析显示,100 μg/mL AKG组与对照组之间存在397种显著差异代谢物,这些代谢物主要富集于三羧酸循环、丙酮酸代谢、谷胱甘肽代谢和NF-κB信号通路等154条关键代谢通路。体外受精结果显示,AKG处理显著提高了体外受精卵裂率,但对囊胚率无显著影响,同时人工授精妊娠率显著提高(34.13% vs. 21.97%),妊娠率提高12.16%。综上所述,在山羊精液冷冻液中添加100 μg/mL AKG可通过调控三羧酸循环、丙酮酸代谢、谷胱甘肽代谢和NF-κB信号通路等代谢过程,有效提升解冻后精子的运动能力、抗氧化能力及能量供应,并抑制凋亡发生,最终显著改善精子的受精能力与人工授精妊娠率。本研究为优化奶山羊精液冷冻保存技术提供了新的有效策略和理论依据。     

滇南小耳猪精液的直接冷冻保存

目的建立滇南小耳猪精液冷冻保存方法,加速云南省特有小型猪种的小型化选育。方法利用脉冲电刺激模式诱导公猪输精管自助收缩排精。利用直接冷冻新技术（DFM）研究不同冷冻方案对精子的运动度、精子顶体完整性和体内授精胚胎发育能力的影响。结果在直接冷冻方法中,3%甘油防冻剂的作用下,60 s植冰时间和1.5 mm/s的冷冻降温参数对精子运动度保护良好,精子运动复苏率达到61.7%。但是,3%乙二醇虽然与甘油一样对精子的顶体完整性都有很好的保护作用,对精子运动度保护能力较差。此外,3%甘油、60 s植冰、1.5mm/s冷冻速度的直接冷冻的冻精解冻,移植到超数排卵的母猪子宫颈口实施人工授精,获得卵的受精和胚胎发育潜能尚可。结论玻璃管直接冷冻可以完成滇南小耳猪精子的冷冻保存。     

猪精液冷冻保存影响因素的研究进展及展望

由于在经济生产中的重要意义,猪精液冷冻保存技术成为研究的焦点。早期的研究多集中在对冷冻保护剂和冷冻方法的筛选与优化上,为猪精液冷冻保存进行了深入的探索。但研究表明,无论采用何种冷冻保护剂、何种冷冻方法都损害了精子的受精能力,并伴随有蛋白质的丢失、表达量的改变、功能活性的增减等,这种研究现状迫使该领域的研究向充分揭示冷冻对精子损伤的机理方向转移,希望通过揭示冷冻保存所导致的蛋白质结构和功能改变的实质,充分阐明冷冻损伤的机理,为猪精液冷冻保存提供理论依据,并最终促进猪精液冷冻保存技术的快速发展。     

秦岭大熊猫精液的细管冷冻保存

2008年3月1日至4月27日和2009年3月3日至5月1日,在陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心对处于繁殖期内的4只雄性秦岭大熊猫(Ailuropodamelanoleucaqinlingensis)精液进行了细管冻精实验.比较组成不同的4种稀释液;葡萄糖-果糖-柠檬酸三钠-卵黄-甘油-双抗(稀释液1)、葡萄糖-蔗糖-柠檬酸三钠-卵黄-甘油-双抗(稀释液2)、葡萄糖-柠檬酸三钠-卵黄-甘油-双抗(稀释液3)和美国进口的TEST(加入3.5％甘油),以及直接降温平衡法(方法1)与逐级降温平衡法(方法2)2种冷冻保存操作方法,对秦岭大熊猫精液进行细管冷冻保存后精子活力和顶体完整率的影响.结果表明:稀释液1的精子活力为46.25％±11.67％,顶体完整率为80.75％±7.89％,TEST的精子活力为48.75％±8.54％,顶体完整率为84.50％±7.59％,两者的精子活力和顶体完整率均无明显差异(P＞0.05),但是都明显高于稀释液2(P＜0.01)和稀释液3(P＜0.01);采用方法1冷冻保存秦岭大熊猫精液,解冻后精子的活力和顶体完整率分别为45.67％±10.54％和81.37％±8.42％,都显著高于方法2(P＜0.01);方法1解冻后畸形率为23.50％±3.51％,明显低于方法2(P＜0.01).经比较确定,方法1(用稀释液1)是一种较好的细管冷冻保存秦岭大熊猫精液的方法.     

软鳍新光唇鱼精子的超低温冷冻保存

2011年,对软鳍新光唇鱼(Neolissochilus benasi)进行了精子超低温冷冻保存研究。以解冻后的精子活力为指标,采用稀释液D-15,设计不同的抗冻剂种类和浓度,以及不同的实验条件(包括冷冻体积、4℃平衡时间和解冻温度等)探索软鳍新光唇鱼精子的超低温冷冻保存方法。筛选出了适合软鳍新光唇鱼精子超低温冷冻保存的两种抗冻保护剂及其浓度分别为10%MeOH和15%EG,确定了精液与稀释液的最适稀释比例为1:7、4℃平衡时间区间为10～60min、冷冻体积为60μL,以及复苏方法为37℃水浴快速解冻30s。当鲜精活力为(62.33±2.05)%,综合以上最佳实验条件进行保存,解冻后精子的最高活力为(29.67±0.47)%,但效果不理想,不能达到广泛生产运用水平;产生这一结果,可能与异地保育物种的饲养管理有关。因此,在亲鱼培育管理中要最大限度地降低捕获诱发的压力,尽量提供适合的养殖条件。在珍稀鱼类异地保育时,繁殖用雄鱼的培育与雌鱼同等重要,是获得大量高质量仔鱼的关键。     

基于电容测定的罗汉果细胞超低温保藏快速方法

建立了一种基于活细胞电容值定量测定的植物细胞超低温保藏的快速评价方法,优化了罗汉果细胞超低温保藏方法。通过采用活细胞传感仪测定冻存后细胞的存活率并结合细胞生活力(细胞线粒体活性/TTC)对罗汉果细胞的低温保藏过程进行优化,确定了罗汉果细胞较为适宜的冷冻保护剂组分为基本培养基中添加10%的蔗糖和10%的DMSO。预处理剂的考察实验表明,采用0.2 mol/L蔗糖的预处理剂处理细胞时冻存后细胞存活率和细胞活力较高;采用0.2 mol/L蔗糖预处理剂处理细胞时,随着预处理时间的增加,细胞存活率先增加后降低,预处理时间为9 h时,细胞存活率和细胞活力最高。保藏后的细胞复苏实验结果表明:细胞存活率与采用活细胞电容值得到的细胞存活率具有很好的一致性,同时经过冻存的细胞复苏培养后,仍保留了原始细胞的形态和合成甜苷V的特性,说明该冻存方法适用于罗汉果细胞的超低温保藏。因此基于活细胞传感仪测得的电容值进行细胞冻存过程细胞活性的快速评价方法具有较好的可行性和可靠性。     

甜菜夜蛾卵的超低温冷冻保存(英文)

通过对甜菜夜蛾卵超低温冷冻过程中一系列影响因子的研究 ,建立了甜菜夜蛾卵在液氮中冷冻保存的方法。结果表明 ,利用 1 5%次氯酸钠处理卵壳 6min ,再用异丙醇处理 1 5sec和N 己烷处理 30sec可有效去除甜菜夜蛾卵的外卵壳和蜡质层 ,获得 95%以上的渗透化率和 60 %左右的存活率 ;渗透化卵经 2mol L乙二醇初步抗冻 30min和含 1 0 %BSA的 8 5mol L乙二醇脱水 5min ,约有 55%～ 60 %的卵存活和2 4 %的卵孵化 ;将抗冻处理后的卵投入液氮 ( - 1 96℃ )中 2 4h ,在 37℃下解冻 ,结果有 ( 1 6 3± 7 6) %的卵发育至黑头期 ,( 1 6± 1 1 ) %的卵孵化。     

猪精液冷冻损伤机理研究进展

阐明降温-升温过程精子损伤的原因是目前冷冻生物学的研究热点之一。借助分子生物学手段,猪精子冷冻损伤研究已深入到分子水平,对在冷冻过程中的损伤机理研究方面取得很大突破。在参考国内外文献的基础上,综述了猪精液冷冻损伤机理在近几年来的研究进展。     

精子冷冻保存技术及研究进展

精子冷冻是辅助生殖技术的基础,能够有效的保存有价值的基因资源。文章回顾了近些年来国内外精子冷冻保存的重要研究成果,分析了精子的来源、冷冻预处理、冷冻和解冻方法、防冻剂的选择及其加入去除方式的选择等因素对精子冷冻效果的影响。文章还总结了精子冷冻效果的评价方法,展望精子冷冻技术的发展方向和应用前景。     

饥饿对胭脂鱼血液指标及造血的影响

对胭脂鱼[体长141—178 mm,体重(94.82±4.52)g]在26.0—27.5℃进行禁食,研究了不同饥饿时间(0、5、10、20、30、60d)对其血液指标和造血的影响。结果表明,饥饿对胭脂鱼RBC、Hb、MCV、MCH和MCHC等生理指标都有显著影响,而对WBC和HCT影响不显著。饥饿5—30d之间,外周血红细胞中含有较多数量的未成熟红细胞和较年轻的成熟红细胞,饥饿至60d时新生红细胞的能力严重减弱。饥饿60d的胭脂鱼出现大量断裂核红细胞,显示了营养不良造成的细胞病理学特征。血红蛋白含量和红细胞压积的变化与红细胞数量变化趋势一致。除胆固醇和谷草转氨酶外,其余各项生化指标均受到饥饿的显著性影响。血糖对饥饿较敏感。持续饥饿使肾脏、头肾、脾脏、肝脏等造血器官体积减小、内部结构排列疏松、细胞萎缩、造血区解体。随饥饿时间的延长,造血器官中成熟和趋向衰老的血细胞数量明显增多,各种原始和幼稚血细胞减少,造血机能下降,甚至丧失。饥饿使胭脂鱼造血过程和原有红细胞的衰老过程减缓,从而降低能量的代谢:当饥饿对鱼的生存产生胁迫时,作为能量节省机制,保存现有红细胞和停止红细胞生成可能是鱼类耐受饥饿的常用对策。     

超低温冷冻对羯布罗香种子结构和生理生化特性的影响

为长期、稳定、有效地保存羯布罗香(Dipterocarpus turbinatus Gaertn.F.)种子,探讨了低温冷藏对种子活力、结构和生理生化指标的影响。结果表明,45%的含水量是种子的安全储藏含水量;玻璃化冷冻和缓慢冷冻对种子结构损害较大,且冷冻后的种子活力下降幅度大;快速冷冻法是种子超低温保存的最佳冷冻方式;液氮冷冻降低了种子过氧化物酶、过氧化氢酶和脱氢酶活性,提高了α-淀粉酶活性,而对丙二醛含量无显著影响。因此,超低温保存羯布罗香种子是科学可行的。     

圈养大熊猫冷冻精液对其种群遗传多样性的作用

在过去34年的圈养大熊猫种群保护工作中,我们成功建立了全球最大的大熊猫精子库,目前已保存50只大熊猫个体总计7 000余支细管冷冻精液(冻精)。冷冻精液一方面可以使物种的遗传资源得到长久保存,另一方面可以通过人工授精的方式促进种群繁育。但是,圈养大熊猫冷冻精液对其种群遗传多样性的作用尚未有明确报道。本研究首先根据成都大熊猫繁育研究基地2000—2014年冷冻精液人工授精数据,对比分析了冻精人工授精个体和圈养种群的遗传多样性。结果显示,冻精人工授精个体遗传多样性均高于同年圈养种群的平均遗传多样性,表明在繁殖年份中冻精人工授精可以显著提高圈养大熊猫种群的遗传多样性。统计精子库中所有冻精个体的平均血缘系数并与圈养种群进行对比分析,探究冷冻精液对圈养种群遗传多样性的潜在作用。结果显示,精子库中有21只已死亡个体的精液,其中有66.67%的个体平均血缘系数低于圈养种群;有14只20岁以上个体的精液,其中有50.00%的个体平均血缘系数低于圈养种群;另有15只20岁以下个体的精液,其中有53.33%的个体平均血缘系数低于圈养种群,表明冷冻精液对圈养种群遗传多样性的保护具有重要价值。综上所述,冷冻精液不但有效保存了大熊猫遗传资源,而且在保护圈养种群遗传多样性方面具有积极的促进作用。     

太子参超低温脱毒及规模化组培育苗技术

以太子参茎尖为外植体,采用超低温去除病毒方法,通过组织培养研究了芽增殖诱导、丛生芽诱导、生根壮苗诱导的适合条件,以期形成太子参规模化育苗技术。结果表明：超低温处理1 h后,太子参脱毒率可达90%以上;规模化组培育苗最适宜配方为初代培养基为改良MS＋2.5 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L IAA继代增殖培养基为改良MS＋1.2 mg/L KT＋0.5 mg/L NAA,壮苗生根培养基为改良MS＋0.2 mg/L KT＋1.5 mg/L DA-6＋10%蛋白粉。