马氏珠母贝Sox11基因的克隆及时序表达模式分析

为探究Sox(SRY-related HMG-box genes)基因家族在马氏珠母贝个体发育及性别分化中的作用, 研究首先利用兼并引物从马氏珠母贝基因组中克隆到一个HMG框(high mobility group box), 利用RACE-PCR技术从SMART cDNA文库中克隆到一个Sox基因的cDNA全长, 通过Clustal X和MEGA 4软件对该序列进行比对分析并构建系统进化树; 通过荧光定量PCR技术对该基因在不同组织及发育不同时期性腺中的表达情况进行分析。结果显示, 马氏珠母贝该Sox基因的cDNA全长为1579 bp, 其中开放阅读框(ORF)为1008 bp, 编码336个氨基酸, 5'非编码区为126 bp, 3'非编码区为445 bp。同源性分析表明, 马氏珠母贝Sox基因与太平洋牡蛎Sox11基因的同源性(Identity)最高, 为80%, 故命名为pmSox11; 系统进化树分析也显示pmSox11与太平洋牡蛎Sox11基因的亲缘关系最近。荧光定量PCR分析组织表达特异性显示, pmSox11在马氏珠母贝神经节分布较多的组织如外套膜、鳃、足、消化盲囊等大量表达, 在神经节相对较少的闭壳肌和卵巢中表达量较少; 时序表达图谱显示, pmSox11在3月龄幼贝性腺和1年龄发育早期精巢中表达量最高, 在2年龄成熟精巢和2年龄性转换性腺中表达量降低, 而在2年龄卵巢中表达量最低。研究表明, pmSox11基因可能在马氏珠母贝早期神经系统发育和性别发育的调控方面起到重要作用。     

华贵栉孔扇贝Akirin 2基因的克隆与表达分析

为了解Akirin在华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)中的作用,本研究分离了华贵栉孔扇贝Akirin 2基因(命名为CnAkirin 2),并描述了CnAkirin 2的特征。使用转录组分析和PCR方法获得了CnAkirin 2 cDNA序列,通过序列比对分析了Akirin氨基酸序列在不同物种中的保守性,使用MEGA 7.0软件的邻接法构建了Akirin 2的系统进化树,使用实时定量PCR分析了Akirin 2在华贵栉孔扇贝6种不同组织中的表达。结果显示:该基因序列全长1 888 bp,开放阅读框长597 bp,编码氨基酸198个;CnAkirin 2的预测分子量为22.11 kD,理论等电点pI为9.30,具有核定位信号PKRRRCM;不同物种Akirin氨基酸多序列比对结果显示,推译的CnAkirin 2氨基酸序列与其他物种Akirin氨基酸序列在N端和C端具有高度相似性;使用邻接法构建的系统进化树显示CnAkirin 2与牡蛎和其它扇贝等贝类Akirin聚为一支;实时定量PCR结果表明CnAkirin 2在不同组织中均有表达,其中在精巢表达量最高,其次为卵巢,在其它组织中的表达水平最低,推测其可能在性腺发育过程中发挥重要作用。本研究为探索Cn Akirin 2在华贵栉孔扇贝中的作用奠定了基础。     

中华鳖Foxl2基因克隆及外源性激素对其表达的影响

外源性激素在中华鳖(Pelodiscus sinensis)性别决定有重要作用, 为给中华鳖性别决定机制研究提供生物学信息, 首次克隆和分析了中华鳖Foxl2 cDNA部分序列。为研究其在遗传和生理水平的差异, 以10 mg/kg剂量17α-甲基睾酮(MT)和17β-雌二醇(E₂)分别对中华鳖雌雄个体注射, 检测0、6h、12h、24h、48h、7d和14d性腺Foxl2 mRNA表达水平。获得中华鳖Foxl2基因(GenBank登录号: KP734210)部分 cDNA长903 bp, 共编码300个氨基酸, 属于叉头框转录因子家族, 参与卵巢发育和功能维持; 多重序列比对显示, Foxl2具有典型的FH结构域, 与红耳龟的同源性最高, 达到99%; 系统进化树分析显示, 中华鳖Foxl2基因与爬行动物Foxl2基因聚为一个亚支, 且与西部锦龟Foxl2基因距离最近。荧光定量PCR结果显示, 与对照组相比, 注射E₂后24h, 卵巢Foxl2 mRNA表达水平被极显著上调(P<0.001), 7d和14d后, 精巢Foxl2 mRNA表达水平极显著上升(P<0.001); 注射MT后24h, 精巢和卵巢Foxl2 mRNA的表达水平均极显著升高(P<0.001)。结果表明, E₂和MT促进Foxl2表达, E₂促进其表达的性别差异比MT明显。研究可为了解Foxl2的功能及明确外源性激素调控中华鳖Foxl2的分子机制提供基础资料。     

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)Pm-SCD基因的克隆及其对温度胁迫的响应

硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase, SCD)是合成单不饱和脂肪酸的限速酶。本实验利用RACE技术克隆获得了马氏珠母贝SCD (Pm-SCD)基因,并对其基因和氨基酸序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用荧光定量PCR技术分析了该基因在不同组织的表达模式及在鳃中不同温度下的时序表达模式。序列分析表明,Pm-SCD c DNA序列全长为1 588 bp,其中开放式阅读框948 bp,5'UTR 200 bp,3'UTR 440 bp,编码315个氨基酸,理论蛋白分子量为36.52 kD,理论等电点为9.63。SMART软件分析显示Pm-SCD蛋白具有SCD典型的脂肪酸去饱和酶结构域FA_desaturase,以及3个组氨酸簇和3个跨膜区。多序列比对结果表明Pm-SCD与太平洋牡蛎SCD同源性最高,为68%;系统进化分析发现,Pm-SCD与太平洋牡蛎等软体动物聚为一支。组织表达定量分析结果显示,Pm-SCD在马氏珠母贝多个组织中均有表达,在性腺中表达量最高;对不同温度下鳃组织中Pm-SCD的时序表达分析发现,在处理后各时间点低温组(17℃)基因表达水平最高,且均显著高于对照组(22℃)、高温组(32℃)。以上结果表明Pm-SCD可能参与马氏珠母贝的低温胁迫响应。该研究为进一步探索Pm-SCD在马氏珠母贝在温度适应性中的作用提供了基础资料。     

中华鳖4个Sox基因保守区的序列分析

采用PCR技术,扩增和克隆了中华鳖Sox基因（TSSox）。经DNA序列分析显示,Sox基因在系统进化上十分保守,其中TSSox4与鸟类LF4基因编码的氨基酸序列完全相同、与人类SOX4和Sox4编码的序列仅一个氨基酸的差异;TSSox5与鸟类的LF5基因的编码也仅一个氨基酸发生了改变;TSSox2与海龟的TSox2相似性最高。4条TSSox序列中,TSSox与人SRY基因序列相似性最高,达75％;序列上的相似性可能暗示了它们在功能上的保守性。     

新疆无苞芥锌指蛋白基因的克隆及表达分析

利用同源克隆法从新疆无苞芥中克隆获得1个锌指蛋白基因(OpZFP)。序列分析表明,OpZFP基因的开放阅读框为684bp,推测编码含227个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示,OpZFP蛋白含有1个典型的C2H2型锌指结构,在C端含有一个可能具有转录抑制功能的EAR结构域。系统进化树分析表明OpZFP编码产物与拟南芥AtZFP1、琴叶拟南芥AlZFP1的进化关系较近。分离了OpZFP基因2 095bp的启动子序列,发现该启动子与拟南芥AtZFP1基因的启动子序列只有84.4%的相似性,启动子分析表明二者存在多处不同的顺式作用元件。半定量RT-PCR分析表明,OpZFP在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,在根中的表达量最高。OpZFP基因受高盐、干旱和低温等胁迫的诱导表达,表明该蛋白涉及多种胁迫相关的信号传导途径。     

黄鳝性逆转过程中Gsdf基因cDNA片段的克隆和表达分析

通过RT-PCR法从黄鳝性腺中首次克隆获得黄鳝Gsdf(gonadal soma-derived factor)基因的片段序列,该片段序列长218 bp,编码72个氨基酸。氨基酸序列分析表明黄鳝Gsdf基因片段与其他物种的相似性在61%~76%之间,其中与舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)GsdfⅠ型、舌齿鲈GsdfⅡ型同源性最高,均为76%;系统进化树显示,黄鳝Gsdf与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)Gsdf基因聚成一支,与鲈形目鱼类亲缘关系较近。此外,不同性腺组织的基因检测结果显示,黄鳝Gsdf在卵巢和间期性腺的表达量很低,两者没有显著性差异(P0.05);在精巢组织中的表达量显著高于卵巢、间期性腺组织的表达量(P0.05)。上述结果表明Gsdf基因可能在黄鳝的性腺尤其是精巢的分化和发育过程中起着重要的作用。     

牙鲆cbx2基因的分子特征与组织表达

为鉴定牙鲆(Paralichthys olivaceus)色素框同源蛋白(Chromobox homolog,CBX)基因cbx2及探讨其在牙鲆性腺中的表达,通过PCR克隆和测序获得了cbx2 cDNA序列;利用多种生物信息学方法在线分析了牙鲆CBX2蛋白质的理化性质与空间结构,并比较了脊椎动物中cbx2的基因结构、氨基酸同源性、系统进化;运用RT-PCR技术分析了cbx2基因在牙鲆成体不同组织的表达情况。结果表明获得的牙鲆cbx2 cDNA序列包含1 584 bp的开放阅读框,编码527个氨基酸,其蛋白质分子量和等电点分别为56 578.98和10.03,是一种偏碱性的亲水性蛋白,该蛋白无信号肽,无跨膜区域,且编码该蛋白的氨基酸中以丝氨酸(Sr)的含量为最高;空间结构分析发现,牙鲆CBX2蛋白以α螺旋和无规则卷曲为主,其二级结构中含有1个染色质结构域和4个低复杂结构域,该染色质结构域常结合甲基化氨基酸残基。基因结构、氨基酸同源性和系统进化分析表明cbx2基因在脊椎动物进化中较为保守,牙鲆cbx2与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、青鳉(Oryzias latipes)的基因结构更为相似,其氨基酸同源性与杜氏鰤(Seriola dumerili)最高,为89%。RT-PCR结果显示牙鲆cbx2基因在精巢的表达量最高,卵巢次之,而在其他组织中仅有较低的表达。这些结果提示了cbx2基因在牙鲆的性腺发育中可能具有重要作用。     

烟草二脂酰甘油酰基转移酶基因(NtDGAT2)的克隆与功能分析

二脂酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,DGAT2)是植物储存油脂生物合成过程中的关键酶,对种子储存油脂累积具有重要的生理作用。本文采用电子克隆与实验相结合的方法,从烟草种子cDNA中克隆到DGAT2基因的开放阅读框序列,命名为NtDGAT2(GenBank登录号JX843807),其序列长999bp,编码332个氨基酸。多序列比对和进化分析表明该基因编码蛋白与其他植物DGAT2具有较高相似性和典型的DGAT2结构域。利用Real-time PCR定量表达分析显示Nt-DGAT2在烟草种子、花、茎、叶和根里面都有表达,且在发育中的种子和花的发育过程大量表达。酵母互补实验证实该基因编码蛋白具有DGAT酶活性。     

玉米亚硫酸氧化酶基因的克隆及其结构与表达分析

为明确亚硫酸氧化酶(sulfite oxidase,SO)基因的结构特征和进化关系及其在玉米不同组织器官发育过程中的表达和分布特性,采用RACE技术克隆了玉米SO基因(ZmSO)的全长cDNA。序列分析表明,获得的ZmSO全长1 492bp,其中5′-UTR 160bp,3′-UTR 138bp,开放阅读框为1 194bp,编码397个氨基酸组成的蛋白质。对该基因编码氨基酸保守结构域的分析发现,ZmSO包含1个钼辅因子结合域、1个自身二聚化域和1个过氧化物体靶信号序列。系统进化分析显示,SO在进化上较为保守,玉米与其它植物的SO相似性较高。荧光定量RT-PCR分析表明,在玉米成株期,根、茎、叶、雄花和幼穗中,ZmSO在根部表达丰度最低,在叶片和幼穗中表达量较高。酶活性测定结果显示,不同器官中SO活性与其mRNA转录水平上的表达趋势相似。     

小鼠Mterf2基因cDNA的克隆、序列分析与组织表达特征

目的:克隆BALB/c小鼠线粒体转录终止因子2(Mterf2)基因cDNA编码区序列,分析Mterf2 mRNA和蛋白质在小鼠大脑、心、脾、肺、肾、肝、胰腺、肌肉和睾丸等9种组织中的表达情况。方法:以BALB/c小鼠肝组织总RNA为模板,RT-PCR扩增Mterf2基因cDNA编码区序列,将其克隆至pMD-19T载体,通过菌落PCR、双酶切和DNA序列测定进行验证;采用MEGA 6.0软件构建Mterf2基因系统发生树;通过Northern印迹和qRT-PCR方法检测Mterf2基因mRNA在小鼠各组织中的表达量;通过Western印迹检测MTERF2蛋白在小鼠多个组织中的表达量。结果:克隆获得BALB/c小鼠Mterf2基因cDNA的编码区序列,其全长1158 bp,编码385个氨基酸残基,克隆到的序列与GenBank参考序列的同源性为100%,无任何碱基突变和移码突变。小鼠Mterf2基因与大鼠Mterf2基因的同源性最高,达到91.0%,在系统发生树上聚类为一簇。Mterf2基因mRNA和蛋白质在BALB/c小鼠心、脑、肝和肾等新陈代谢旺盛的组织中表达丰度最高,其次是在胰腺、睾丸和肌肉组织,而在脾和肺组织中表达相对较低。结论:克隆了BALB/c小鼠Mterf2基因cDNA的编码区序列,并进行了多种组织的表达特征分析,为后续研究Mterf2基因在实验动物体内的生理功能奠定了基础。     

甘蓝型油菜赤霉素受体基因的克隆与表达

采用同源克隆技术从甘蓝型油菜中克隆到1个赤霉素受体基因,命名为BnGID1B(GenBank登录号为HQ589349).该基因含有1个内含子和2个外显子,其cDNA序列全长1 077 bp,编码358个氨基酸,推测蛋白质的相对分子量是40 203.4 Da,理论等电点为6.26.序列比对结果显示,BnGID1B基因与拟南芥GID1B基因核苷酸序列的相似性为86.3%,氨基酸序列的相似性为91.64%.实时荧光定量PCR分析表明,BnGID1B基因在苗期不同组织以及不同激素处理下的表达量有所不同,主要在根中表达,下胚轴中的表达量明显低于根,可见该基因具有一定程度的组织表达特异性.     

白及蔗糖合成酶基因的克隆及表达分析

为揭示白及蔗糖合成酶基因与生长发育的关系,该研究以白及为材料,利用RT-PCR技术同源克隆白及蔗糖合成酶的关键基因SuSy,对SuSy基因的生物学特性及表达特征进行了分析,并利用实时荧光定量PCR检测SuSy基因在不同组织中的表达规律。结果表明:(1)白及SuSy基因长度为2 215 bp,编码737个氨基酸,与铁皮石斛、文心兰和蝴蝶兰的蛋白质氨基酸序列的相似性分别为97%、92%和95%。(2)生物信息学分析表明,SuSy蛋白质序列具有较高的亲水性,与拟南芥SuSy蛋白质氨基酸三级结构一致性为75.2%;系统进化树分析发现,白及SuSy蛋白与铁皮石斛处于同一个分支上。(3) qRT-PCR结果表明,SuSy基因在叶片中的表达量最高,块茎中的表达量最低;成熟叶片的表达量高于未成熟叶片的表达量;数据差异性分析显示,SuSy基因在根、块茎中表达量具有极显著性差异,但在一年生叶和二年生叶中的表达量无显著性差异,幼苗叶和一、二年生叶中表达量具有极显著性差异。由此推测,SuSy基因可能受生长发育的诱导,是调控白及生长发育关键基因。     

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)Pm-HK基因的克隆及其对温度胁迫的响应

己糖激酶(hexokinase, HK)是糖酵解过程中的首个限速酶。本实验利用RACE技术克隆获得了马氏珠母贝HK (Pm-HK)基因,并对其基因和氨基酸序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用荧光定量PCR技术分析了该基因在不同组织的表达模式及不同温度下的时序表达模式。序列分析表明,Pm-HK cDNA序列全长为2 403 bp,其中开放式阅读框1 548 bp,5'UTR 74 bp,3'UTR 781 bp,共编码515个氨基酸,分子量为57.67 kD,理论等电点为6.08。结构域分析发现Pm-HK具有两个完整的保守功能域Hexokinase_1、Hexokinase_2,以及两个Glucose-6-Phosphate结合位点、三个Glucose结合位点,两个ATP结合位点。多序列比对结果表明Pm-HK与太平洋牡蛎HK同源性最高,为81%;系统进化分析发现,Pm-HK与太平洋牡蛎等贝类HK聚为一支。组织表达定量分析结果显示,Pm-HK在马氏珠母贝肝胰腺中显著高表达;对不同温度下鳃组织中Pm-HK的时序表达分析发现,在处理12 h后各时间点低温组(12℃) Pm-HK基因表达水平最高,且均显著高于中低温组(17℃)、对照组(22℃)和高温组(32℃)。以上结果表明Pm-HK可能参与马氏珠母贝的低温胁迫响应。该研究为进一步探索Pm-HK在马氏珠母贝在温度适应性中的作用提供了基础资料。     

版纳微型猪近交系TDRP1基因克隆、鉴定及mRNA的组织表达特性

目的克隆版纳微型猪近交系（BMI）不育和可育公猪TDRP1基因,分析其序列及mRNA表达水平上的差异,预测其蛋白质功能,并检测该基因在可育公猪中的组织表达分布情况。方法以猪NM_001198925序列为模板,设计特异引物,采用RT-PCR方法结合测序获得TDRP1的c DNA序列并进行生物信息学分析;采用半定量PCR方法检测TDRP1在不育和可育公猪睾丸中的表达规律,分析该基因在可育公猪17种组织中的表达特征。结果获得了BMI TDRP1基因的编码区序列（Gen Bank登录号：KJ186786）,生物信息学分析表明其编码186个氨基酸,蛋白质相对分子质量（Mw）为20.49×10^3,等电点（p I）为5.86,无信号肽,有94.1%的概率位于细胞核,含有1个亮氨酸富集的核输出信号。不同物种的氨基酸序列比对表明猪TDRP1与人、恒河猴、小鼠和大鼠等哺乳动物的TDRP1相似性在73%-83.2%之间,其中与人、恒河猴的相似性较高。mRNA表达分析表明,TDRP1在BMI不育和可育公猪睾丸间表达水平差异无显著,在精囊腺和前列腺中高表达,在睾丸和小脑中中度表达,在大脑和肾脏中低表达,在其余组织中不表达。结论成功克隆了BMI TDRP1基因的全长编码区序列并发现了BMI特有的2个SNP位点;TDRP1基因在BMI不育和可育公猪间序列完全一致,睾丸mRNA表达水平差异无显著性,多组织转录谱分析表明该基因存在明显的组织差异表达现象,在精囊腺和前列腺中有较高表达量,为深入研究TDRP1基因在精子发生方面的作用奠定了基础。     

银杏叶绿体petD基因的克隆与表达

根据黑松、云杉、菠菜与玉米叶绿体petD基因序列设计引物,以银杏叶绿体基因组DNA为模板,PCR扩增克隆了银杏叶绿体petD基因（GenBank登录号为DQ923066,命名为GbpetD）的序列。序列分析显示,GbpetD基因组DNA序列编码区长1243bp,含1个内含子和2个外显子,其外显子序列编码177个氨基酸。相似性比对显示,该基因编码区序列与云杉、台东苏铁、黑松、莴苣、木薯、北美落叶松的petD基因核苷酸同源性为84％-99％,氨基酸序列同源性为85％-93％。系统进化树分析结果表明GbpetD蛋白质与黑松、北美落叶松、云杉、苏铁等裸子植物的petD蛋白质聚类关系最近。半定量RT—PCR分析表明,GbpetD基因在银杏叶和茎中表达,在叶中表达量最大。     

小立碗藓叶绿体分裂相关基因PpMinE的克隆及其功能与进化分析

用RT-PCR技术从小立碗藓中(Physcomitrella patens)克隆了核编码的MinE基因,命名为PpMinE,并克隆了该基因的基因组DNA。序列比对显示该基因编码的蛋白质与真细菌和绿藻叶绿体编码的MinE蛋白具有较高的相似性。pMinE-EGFP融合蛋白在烟草中的瞬时表达证明该蛋白定位于叶绿体内。在大肠杆菌中过量表达PpMinE导致细胞不正常分裂,产生无染色体的小细胞,这表明MinE的功能在进化上是保守的。在系统发育树中,PpMinE和高等陆生植物有较近的亲缘关系。在已知的陆生植物的叶绿体基因组中没有找到MinE的同源蛋白,这暗示在进化过程中MinE从叶绿体到细胞核的水平转移可能发生在陆生植物发生以前。     

翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的克隆及表达研究

采用同源克隆与SMART RACE技术首次分离和克隆了翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的c DNA全长,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)技术分析了其在翘嘴鳜成体不同组织及性腺不同发育时期的表达特点。序列分析结果显示,CYP19a基因全长1 873 bp(Gen Bank登录号为KX911988),其中开放阅读框长1 581 bp,编码526个氨基酸。通过多序列比对,发现该基因编码的蛋白质具有P450arom A特定的功能保守序列,包括I-螺旋区、Ozol肽区、亚铁血红素结合区域以及芳香化酶特异性结合区域;同时,CYP19a基因序列的同源性分析结果显示,其在脊椎动物中较为保守。此外,q PCR检测结果显示,CYP19a基因在翘嘴鳜成体组织中的表达存在显著差异(P0.05),主要在性腺中表达,其次在脑和肝脏有少量表达;而且CYP19a基因在繁殖期性腺中的表达量显著低于非繁殖期性腺中的表达量(P0.05)。以上研究表明,CYP19a基因在鱼类性腺形成及发育过程中具有重要作用。     

星星草铁蛋白基因PtFer的克隆及表达分析

目的:从星星草中克隆一个铁蛋白相关基因,分析其序列特征及基因表达模式。方法与结果:构建星星草RACE cDNA文库,根据GenBank中报道的铁蛋白基因EST序列设计引物,利用RACE方法克隆得到星星草铁蛋白基因PtFer的全长cDNA序列(GenBank登录号为HM125047);序列分析表明,PtFer的核苷酸序列长度为751 bp,开放读框为336 bp,编码111个氨基酸残基,预测蛋白质相对分子质量为12.8×103。其蛋白质序列具有铁蛋白的特征性保守区域,与水稻属同一进化分支,与其他禾本科植物铁蛋白的序列相似性达80%以上。Northern杂交分析表明,PtFer的表达量随Na2CO3的浓度和时间的增加而升高,并在12～24 h内持续保持较高的表达水平。结论:用分子生物学及生物信息学技术克隆并分析了星星草铁蛋白基因PtFer的全长cDNA序列及编码蛋白的结构,并初步探索了盐碱胁迫下其表达模式,为研究植物耐盐碱机理奠定了基础。