鲫鱼PKZ Zα结构域与d(GC)、d(TA)重组质粒的结合

Zα是能够特异性识别并结合左旋DNA(Z-DNA)的蛋白结构域,首先在人ADAR1中鉴定,随后又在ZBP-1(DLM-1)和E3L等蛋白质中发现了该结构域．鲫鱼PKZ是首次报道的具有Zα结构域的鱼类eIF2α激酶．为深入了解鲫鱼PKZ Zα的功能,原核表达并亲和层析纯化了3种多肽,即野生型PZα(Zα1Zα2)、替换型P(Zα1)2(Zα1Zα1)和点突变型（PZαK34A、PZαS35A、PZαR39A、PZαP57A）．同时,构建了含有d(GC)6、d(GC)13、d(TA)13特殊插入序列的3种重组质粒,用于体外模拟Z-DNA．凝胶阻滞实验分析了3种多肽分别与重组质粒的亲和性结果表明,PZα和P(Zα1)2能够与d(GC)重组质粒结合,并且随着多肽含量的增加,阻滞效应越明显．与野生型PZα相比,替换型P(Zα1)2结合d(GC)重组质粒的能力更强PZα和P(Zα1)2还能微弱地与d(TA)13重组质粒结合．点突变型多肽都不能与重组质粒结合,暗示鲫鱼PKZ Zα结构域中这4个氨基酸残基在结合核酸分子的过程中非常关键．该文结果有利于进一步揭示鱼类PKZ Zα结构域与Z-DNA结合的分子机理．     

The Zα domain of fish PKZ converts DNA hairpin with d（GC）n inserts to Z-conformation

PKZ, protein kinase containing Z-DNA domains, is a novel member of the vertebrate eIF2α kinase family. Containing a catalytic domain in C-terminus and two Z-DNA binding domains （Zαl and Zα2） in N-terminus, PKZ can be acti- vated through the binding of Zα to Z-DNA. However, the regulatory function of PKZ Zα remains to be established. Here, to understand the impact of PKZ Zα on DNA con- formational transition, wild-type ZαdZα2 and 11 mutant proteins were expressed and purified. At the same time, several different lengths of DNA hairpins-d（GC）nT4（GC）, （n = 2-6） and an RNA hairpin-r（GC）6T4（GC）6 were synthesized. The effects of ZαdZα2 and mutant proteins on the conformation of these synthetic DNA or RNA hairpins were investigated by using circular dichroism spectrum and gel mobility shift assays. The results showed that DNA hair- pins retained a conventional B-DNA conformation in the absence of ZαdZα2, while some of the DNA hairpins （n 〉 3） were converted to Z-conformation under Zαd Zα2 induction. The tendency was proportionally associated with the increas- ing amount of GC repeat. In comparison with ZodZα2, ZαdZαd rather than Zα2ZαL2 displayed a higher ability in converting d（GC）6T4（GC）6 from B- to Z-DNA. These results demonstrated that Zcd sub-domain played a more essential role in the process of B-Z conformational transition than Zα2 sub-domain did. Mutant proteins （K34A, N38A, R39A, Y42A, P57A, P58A, and W60A） could not convert d（GC）6T4（GC）6 into Z-DNA, whereas S35A or K56A retained some partial activities. Interestingly, ZαlZα2 was also able to induce r（GC）6T4（GC）6 RNA from A-conform- ation to Z-conformation under appropriate conditions.     

Z-DNA结合蛋白与Zα结构域

Z-DNA结合蛋白包括人、哺乳类和病毒中的ADAR1、DLM-1、E3L蛋白以及在鱼类中最新报道的PKR-like（PKZ）,其共同点是都含有Zα结构域。本文简述了这几种蛋白质的结构与功能,并着重分析Zα结构域与Z-DNA、Z-RNA、B-DNA等核酸分子的识别机制和亲和性。     

Z-DNA结合蛋白与Zα结构域

Z-DNA结合蛋白包括人、哺乳类和病毒中的ADAR1,DLM-1.E3L蛋白以及在鱼类中最新报道的PKR-like(PKZ),其共同点是都含有za结构域.本文简述了这几种蛋白质的结构与功能,并着重分析Za结构域与Z-DNA,Z-RNA、B-DNA 等核酸分子的识别机制和亲和性.     

融合蛋白CBD-SPA“Z”基因的构建、表达与活性鉴定

针对金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)层析柱的应用问题,将SPA的Z结构域基因与纤维素结合结构域(CBD)重组,并在Z结构域C端引入1个半胱氨酸(Cys),构建并表达出一种新型免疫亲和材料。利用基因工程技术将质粒pEZZ18中的Z基因插入到含有CBD的质粒pET35b(+)质粒中,构建出原核表达载体pET35b(+)-ZCys,经IPTG诱导表达,获得CBD-Protein Z融合表达蛋白。pET35b(+)-Z-Cys在E.coli BL21中正确表达,所表达的融合蛋白具有与哺乳动物IgG抗体结合的生物学活性和与纤维素结合的活性。结果证明CBD-Protein Z蛋白具有Z结构域与CBD结构域的活性,预计能在免疫亲和层析中用于IgG抗体的纯化。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达研究

采用RT-PCR方法自猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组分离出核衣壳蛋白基因(orf 7),克隆到pMD18-T载体构建成重组质粒pMD18N并进行测序比较,结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与PRRSV美洲型ATCC VR-2332株的同源性为100%,表明orf 7 是PRRSV基因组内很保守的序列;将orf 7亚克隆到原核表达载体pGEX-KG,构建成重组质粒pGEX-KGN,用pGEX-KGN转化表达菌株BL21,经SDS-PAGE和 Western-blot分析表明克隆在谷胱苷肽转移酶(Glutathione S-transferase(GST)下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-N分子量约为41kDa,并且有免疫学反应活性;这为猪繁殖与呼吸综合征的血清学诊断方法的建立打下了基础.     

人类高度进化保守基因hnulp1中转录抑制区段的定位

hnulp1是具有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)的新的一类转录因子.其C端含一个DUF654结构域,其序列在同源基因中相当保守,但该结构域功能未知.利用GAL4转录因子中的DNA结合结构域(DBD)和含有与DBD结合序列的荧光素酶报告基因(GAL4-Luc)质粒,构建了哺乳动物细胞转录因子活性分析系统,随后利用GAL4-Luc荧光素酶报告基因对5种含DUF654结构域的不同缺失片段转录抑制活性进行检测.检测结果表明,该基因DUF654结构域中从Δ228-407氨基酸区段具有强烈的转录抑制活性.该结果为进一步研究DUF654结构域的功能和hnulp1基因转录调控的机制奠定了基础.     

Z—DNA及其生物学功能

Z-DNA是一种处于高能状态、不稳定的DNA分子构象。形成Z-DNA的原因有很多：首先,转录过程中,移动的RNA聚合酶在模板DNA的5’端产生负超螺旋扭曲力,导致Z-DNA的形成;其次,含有d（GC）。序列的核酸分子在高浓度的NaCl、[Co（NH3）6]^2＋盐溶液中也能够形成Z-DNA;最后,化学修饰也可以使DNA产生稳定的Z-DNA。Z-DNA是在体外首先发现的,但随着研究的不断深入,发现Z-DNA在体内也广泛存在并可能具有功能的多样性,包括参与基因表达调控、染色体断裂、基因重组、抗病毒、病毒发生等生物学过程。     

MBD4/MED1的结构与功能

含甲基化CpG结合域蛋白质4(methyl-CpG-binding domain protein 4,MBD4)是MBD核蛋白家族中的一员,它包含一个能特异结合甲基化CpG的MBD结构域和一个具有糖苷酶活性的DNA糖苷酶结构域。该蛋白质能特异地结合甲基化CpG岛,并且在DNA错配修复、抑制转录和调节凋亡等过程中发挥重要功能,并与微卫星不稳定性密切相关。MBD4是一个重要的DNA损伤修复蛋白,多方面的报道表明其许多功能都牵涉到细胞衰老。本文就其结构与功能的研究进展作一综述。     

大黄鱼MSTN成熟肽区基因的原核表达

根据本实验室克隆的大黄鱼肌肉生长抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物,通过RT-PCR法扩增大黄鱼MSTN成熟肽区域的基因,将目的片段插入pMD18-T克隆质粒,并测序验证。验证后用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切含目的片段的pMD18-T克隆质粒和pET-28 a表达质粒,构建MSTN-pET-28 a重组表达质粒。将重组表达质粒转化至BL21菌中,经IPTG诱导后表达蛋白的大小约17 kD。     

esat6基因表达载体的构建及其在戈登链球菌中的表达

为了构建结核分枝杆菌(MTb)esat6基因表达载体并在戈登链球菌GP251中进行分泌表达, 以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板扩增esat6基因, 将esat6基因TA克隆到pMD18-T, 构建pMD18-esat6重组载体。酶切消化pMD18-esat6, 将esat6基因亚克隆到质粒PSMB104, 生成PSMB104-esat6重组载体, 用于转化感受态戈登链球菌表达菌株GP251。用Tricine-SDS-PAGE和Western印迹检测esat6蛋白的表达, 并用ELISA技术检测该蛋白     

广西巴马小型猪血清淀粉样P物质基因真核载体构建及细胞转染

血清淀粉样P物质(Serum Amyloid Pcomponent,SAP)是一种在进化上高度保守的血清糖蛋白,它可与各种类型的原纤维结合,在免疫应答和炎症反应等多种免疫疾病中发挥作用.以广西巴马小型猪肝组织总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增出相应cDNA片段,连接到克隆载体pMD18-T上进行检测,测序结果为675 bp,与GenBank所提供相关序列同源性为100％,并成功构建pEGFP-N1 -SAP重组真核表达载体,利用脂质体(Lipofectamine 2000)介导法将重组质粒导入到NIH-3T3细胞中培养,经转染24 h后,置于倒置荧光显微镜下观察,发现含有重组质粒的NIH-3T3细胞中表达出绿色荧光,为进一步研究SAP基因的功能特点及在试验动物相关疾病模型的应用提供务件.     

枳壳CBF转录激活因子基因片段的克隆

根据不同植物CBF同源基因的保守区设计合成简并引物,采用PCR技术首次从枳壳基因组中分离出一个DNA片段并克隆到pMD18-T载体中.序列测定和分析表明,该片段长464bp,与拟南芥3个CBF基因的核酸序列及其推导的氨基酸序列分别具有79%和67%～69%的同源性,而且推导的氨基酸序列含有同源性更高的AP2DNA结合域和CBF蛋白的两段特征序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR.结果 表明,本研究克隆的片段为枳壳CBF基因片段.     

青鱼Viperin是一种抗病毒蛋白质（英文）

在脊椎动物中viperin已被证明是一种能抵御大多数DNA和RNA病毒的抗病毒蛋白质。本文克隆及鉴定了青鱼viperin。青鱼viperin(bc Viperin)的c DNA由1 828个核苷酸组成,编码360个氨基酸。预测的bc Viperin蛋白包含N端低保守的两性α-螺旋结构域、中间自由基S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)结构域及高保守C端结构域。bc Viperin m RNA在青鱼心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠、肌肉、皮肤和鳃等组织中均有表达。在草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)和鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)感染后,bc Viperin m RNA在上述组织中的表达水平提高。在青鱼尾鳍(Mylopharyngodon piceus fin,MPF)细胞中,bc Viperin m RNA表达水平同样会在GCRV和SVCV感染后发生上升。蛋白质免疫印迹表明bc Viperin蛋白的相对分子质量约为42 k D;He La和EPC细胞中的免疫荧光染色实验表明bc Viperin是细胞质蛋白。编码bc Viperin的质粒在EPC细胞中过表达后能够显著提高细胞抵御SVCV和GCRV的抗病毒能力。以上研究表明bc Viperin是青鱼天然免疫过程中重要的抗病毒蛋白质。     

痘苗病毒E3L蛋白的结构与功能

E3L蛋白是痘苗病毒基因组所编码的一种非常重要的毒力蛋白。E3L结构高度保守,其N端为Z-DNA结合域(Zα),C端为双链RNA结合域(dsRBM),两者均为其致病性所必需。E3L具有抵御宿主细胞干扰素及其诱导蛋白的抗病毒作用,以及抑制细胞凋亡、抵抗RNA干扰等多方面的重要功能,这些策略有助于逃避宿主的抗病毒免疫。     

橡胶树白粉菌MAT相关基因(STE2基因)的克隆及表达分析

以橡胶树白粉菌(Oidium heveae B.A.Steinm)为材料,根据同源性克隆得到一个MAT相关基因的DNA和c DNA序列,命名为OH-MAT2。生物信息学分析表明,这个基因DNA全长为964 bp,具有一个921 bp的完整开放阅读框(ORF),编码307个氨基酸。其编码的蛋白质分子量为35 584.1,等电点为9.78,且是稳定的疏水性蛋白质。氨基酸序列分析该蛋白质具有STE2家族的保守结构域。结构预测表明该蛋白质主要有α-螺旋、β-折叠及转角构成。相对荧光定量显示该基因在侵染不同时段有表达,且差异明显。     

真核蛋白质中G-patch结构域的结构和功能研究

G-patch是广泛存在真核生物蛋白质中的保守结构域,含有六个高度保守的甘氨酸残基,推测它是一种RNA结合结构域,其功能与RNA代谢有关.     

中国荷斯坦牛白细胞黏附缺陷症PCR-RFLP检测方法的研究

本试验根据已知牛染色体上CD18编码基因序列设计引物,提取牛血液和精液DNA,可扩增出338bp的DNA片段,将PCR产物克隆到pMD18-T载体中,对阳性重组质粒进行测序,确定为牛的CD18基因。由于CD18基因的383位碱基由A变为G,而引起牛白细胞黏附缺陷症(BLAD),通过对济南市11个奶牛场356头奶牛及53头荷斯坦种公牛进行了BLAD的PCR-RFLP检测,共检出3头杂合母牛(携带者),占检测母牛群的0.84%,在荷斯坦公牛中只检测到一种基因型,没有发现隐性突变基因的携带者。     

细菌双组分系统应答调控蛋白调控策略的多样性

双组分系统(TCS)是细菌感应并响应外界复杂环境最为重要的信号传导系统,一般由组氨酸激酶(HK)与应答调控蛋白(RR)构成,激酶与调控蛋白之间通过磷酸化进行信号传递.作为信号传导通路的终端,RR通常由N端高度保守的信号响应结构域(REC)和C端可变的效应结构域组成.RR的效应模块通常为DNA结合结构域.在典型的TCS信号通路中,RR磷酸化后DNA结合能力会显著增强,并形成同源二聚体参与下游靶基因的转录调控.随着研究的深入,发现RR的调控模式其实更为复杂、多样,主要表现在以下3个方面:(ⅰ)含DNA结合结构域的RR存在非典型的调控机制,如磷酸化会使RR的DNA结合能力明显降低或丧失,以及不同RR之间可形成异源二聚体;(ⅱ)RR的效应模块除了是DNA结合结构域,还可能是RNA或蛋白质结合结构域,甚至是酶催化结构域;(ⅲ)有些RR仅含REC结构域.本文对RR介导的不同调控模式进行了系统介绍,以展现TCS在感应外界信号后响应策略的多样性及灵活性.     

华葵根瘤菌nifA基因的克隆和功能分析

华葵根瘤菌(Mesorhizobium huakuii即R.astragali)159的nifA基因的序列分析表明,该基因全长1227bp,编码分子量为44734D的Nif A蛋白。与其它NifA蛋白的序列比较发现,华葵根瘤菌NifA蛋白也存在保守的中间结构域和C末端DNA结合结构域,但其氨基端缺失。Tn5定点突变得到的突变体是Nif-表型。构建了nifA基因组成型表达的质粒,此质粒在大肠杆菌中对华葵根瘤菌nifHlacZ有激活作用。