不同葡萄品种CBF1基因的克隆及序列分析

根据欧洲葡萄CBF1基因序列设计1对特异引物,采用PCR方法从山葡萄、贝达、SO4、Ln33和黑比诺的基因组中各扩增出1个DNA片段并克隆到pMD18-T栽体中.经序列测定和分析,各片段均长756 bp,与欧洲葡萄CBF1基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列分别具有98％和99％的同源性,而且推导的氨基酸序列中包含有同源性更高的AP2/EREBP DNA结合域,以及CBFs蛋白的两段特征序列(PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR).结果表明从5种葡萄中均可以克隆出CBF1基因.     

菠菜CBF转录因子基因片段的克隆及序列分析

根据拟南芥CBF基因序列的保守区设计合成一对特异引物,以菠菜基因组DNA为模板,采用PCR扩增的方法扩出一条DNA特异片段并克隆到pMD18-T载体中。用PCR法和酶切分析法对克隆片段进行鉴定并进一步进行核苷酸序列分析。序列测定该片段长为423bp。OMIGA2.0软件分析结果表明,该片段的推断氨基酸序列与黑麦(AAL35759)、小麦(AAL37944)、拟南芥(AAC78646)、大麦(AAL84170)的同源性分别为33.8%、33.1%、30.8%和30%。     

三种不同抗冻性葡萄中CBF2基因的生物信息学分析及植物表达载体构建

从赤霞珠、贝达和山葡萄三种不同抗冻性葡萄的基因组DNA中分别克隆了CBF2全长基因,并利用生物信息学的方法进行了分析。结果显示：三种葡萄的CBF2基因长均为969 bp,编码253 个氨基酸,与GeneBank公布的的序列相比对,核苷酸相似性在96.7%～97.94%之间。生物信息学分析显示3种不同抗冻葡萄的CBF2基因具有连续的开放阅读框,推倒的氨基酸序列具有AP2结合域,初步判断克隆的CBF2具有诱导抗寒性产生的作用。但氨基酸序列、进化树、理化性质、疏水性/亲水性等在抗寒性较强的山葡萄、贝达与抗寒性较差的赤霞珠之间存在一些差异,与GenBank上的原始序列同源性最低的是赤霞珠,而且其CBF2 N端7个氨基酸残基序列与山葡萄和贝达的氨基酸序列存在较大差异,且具有较强的疏水性,这些差异可能与赤霞珠较弱的抗寒特性有关。以带有35S启动子的载体pBI121为基础,成功构建了植物表达载体pBI121 CaMV35S CBF2,为深入研究CBF2基因在葡萄抗寒性中的作用提供了基础资料。     

梅花CBF转录因子的克隆及表达

根据GenBank中与梅花同属的桃、甜樱桃等已发表CBFs转录因子序列设计简并引物,采用PCR和RT-PCR方法,从梅花基因组DNA和cDNA中克隆CBF转录因子片段。结果表明,两种途径获得的CBF基因序列一致,基因全长821bp,编码238个氨基酸,其氨基酸序列具有典型的CBF蛋白特征,包含保守的AP2/EREB DNA结合结构域及CBF家族蛋白特征短多肽序列(PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR)。氨基酸相似性分析结果表明,该基因与欧洲甜樱桃、矮扁桃等CBF转录因子相似性较高。相对荧光定量PCR结果显示,4℃低温胁迫下,其表达量符合CBF转录因子表达特点,随着胁迫时间的增长表达量呈上升趋势,8h时达峰值,说明该基因在低温胁迫下上调表达。     

蓝舌病毒血清5型毒株S7基因编码区的分子克隆与序列分析

目的:对蓝舌病毒(BTV)血清5型毒株(BTV-5)的S7基因编码区(ORF)进行克隆和序列分析。方法:用TRIzol LS试剂提取病毒总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增BTV-5型毒株S7基因的编码区,将扩增片段克隆到pGEM-T Easy载体上,对阳性克隆进行核苷酸序列测定;采用DNAStar和DNASIS v2.5软件对环状病毒属不同种群的S7基因ORF序列及其推导的氨基酸序列进行同源性及系统进化树分析。结果:克隆的基因片段长1050bp,为S7基因开放性读码框的全长序列,编码349个氨基酸残基;与环状病毒属不同血清型毒株比较,核酸序列同源性范围为42.2%～96.6%,推导的氨基酸序列同源性范围为40.4%～99.7%。结论:蓝舌病毒与非洲马瘟病毒、鹿流行性出血热病毒分属于不同种群,群内不同血清型的S7基因ORF序列及其推导的氨基酸序列显示出很高的同源性,而不同种群之间的同源性很低。     

新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因的克隆与序列分析

根据已发表的牛流产型布鲁氏菌(B.abrotus)HtrA(High temperature requirment A)基因的核酸序列设计引物,从新疆绵羊种布鲁氏菌(B.ovis)基因组中扩增到了大约1600bp的片段。将该片段纯化后克隆到PBS-T载体上,对所得到的重组质粒进行PCR鉴定、酶切分析后,对克隆的片段进行测序表明,新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因与发表的牛流产型布鲁氏菌、马耳他布鲁氏菌(B.melitensis)、猪种布鲁氏菌(B.suis)的HtrA基因核苷酸序列的同源性分别为99.68%、99.81%、99.55%,推导的氨基酸序列也存在很高的同源性。     

盐生植物碱蓬Actin基因片段的克隆及序列分析

目的:克隆盐生植物碱蓬(Suaeda glauca)Actin基因片段,为研究其它基因在碱蓬的表达和调控提供内参基因.方法:根据已知植物Acfin基因的保守序列设计一对简并性引物,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段,使用分子生物学软件进行序列分析.结果:获得一段大小为598bp的基因片段,编码198个氨基酸;该序列与其它Actin基因核苷酸序列的同源性均在80%以上,与氨基酸序列的同源性达93%以上.结论:克隆的基因为Actin基因片段,将其命名为SgACT,并登录在GenBank,登录号为EU429457.     

杨树叶绿体3′rps12基因,rps7基因和ndhB基因片段的克隆及序列分析

通过烟草叶绿体相关序列设计引物 ,从杨树的叶绿体基因组中克隆出 2个相邻的DNA片段 .经分析发现 ,这 2个DNA片段包含核糖体蛋白 3′rps12、rps7基因和NADH脱氢酶第二亚基ndhB基因片段 .利用DNAMAN等软件 ,将扩增到的杨树叶绿体DNA片段与烟草、拟南芥、玉米和黑松的相关序列进行比较 ,证实所扩增的片段具有较高的保守性 ,尤其是在这 3个基因的编码区 ,同源性均在 90 %以上 .插入或缺失常发生在基因间隔区 ,同源性在 80 %左右 ;对其编码区所推导的氨基酸序列进行了比较 ,同源性均在 92 %以上 .首次克隆了杨树叶绿体的部分DNA序列 ,详细报道并分析了杨树 3′rps12、rps7基因和ndhB基因片段及其边界序列信息 .所报告的基因序列均已登录GenBank .     

蒙古冰草Actin基因片段的克隆及序列分析

旨在利用同源序列法分离蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)Actin基因同源片段,为研究其他基因在蒙古冰草中的表达和调控提供内标参照.根据禾本科植物小麦Actin基因(AB181991)的保守序列设计2对引物A4和A5,采用RT-PCR扩增蒙古冰草的Actin基因片段,分别得到656 bp和848 bp的片段,使用DNAman和DNAuser等分子生物学软件进行序列分析,将2个片段的重复序列合并后获得一段长度为962 bp的基因片段,编码237个氨基酸,将克隆的Actin基因片段命名为MwACT.该序列与其它植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在80%以上,其中与小麦、大麦的同源性达到94%;与氨基酸序列的同源性均在90%以上.     

木薯Actin基因片段的克隆及序列分析

克隆木薯Actin基因片段,为研究其他基因在木薯中的表达和调控提供内参基因.通过比较拟南芥、蓖麻和麻风树Actin基因cDNA同源区域,根据基因的保守序列设计一对简并性引物,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段,使用分子生物学软件进行分析.结果显示,获得一段大小为698 bp的基因片段,编码233个氨基酸;该基因序列与其他Actin基因核苷酸序列的同源性均在85%以上,氨基酸序列的同源性达94%以上;系统进化分析表明,木薯Actin基因与大戟科植物橡胶、麻风树及蓖麻的亲缘关系最近,与毛果杨、陆地棉及木瓜等植物Actin基因具有较高的保守性.克隆的基因片段为木薯Actin基因片段,并命名为msACT.