中国对虾一种球状病毒的分离提纯及其核酸蛋白特性的研究

从感染致病的中国对虾（Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｓｉｓ）中分离到一种球状病毒,其育径约为２０±４ｎｍ。进行人工感染实验,对虾死亡率为６６％;用脱氧核糖核酸酶（ＤＮａｓｅ）,核糖核酸酶（ＲＮａｓｅ）及二苯胺染色法对病毒核酸进行处理,证明该病毒核酸为脱氧核糖核酸,用Ｓｌ核酸酶（Ｓｌｎｕｃｌｅａｓｃ）对该核酸进一步消化处理,进一步证实该病毒含单链ＤＮＡ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示,该病毒含４条结构多肽,其分子量分别为８６ｋＤ,７９ｋＤ,７０ｋＤ及２５．５ｋＤ。根据上述特性分析,该病毒可能属于细小病毒科（ｐａｒ－ｖｏｖｉｒｉｄａｅ）,故暂定名为中国对虾细小病毒（ＰｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｓｉｓＰａｒｖｏｖｉｒｕｓ简称ＰｃＰＶ）。     

中国对虾两种球状病毒的免疫检测

以江苏、河北某虾场病虾组织中提取的对虾的两种球状病毒作为抗原,制备出特异性强、效价较高的抗血清,用对流免疫电泳,酶联免疫吸附,免疫电镜技术对五个不同地区的病虾材料进行检测,结果表明：江苏、青岛、河北地区的病虾组织中均含有相应的球状病毒病原。     

中国对虾球状病毒垂直传播的初步研究

应用透射电镜技术在越冬中国对虾雌性亲虾体内检测出一种球状病毒,直径为80nm左右。人工感染实验证实该病毒颗粒具有感染性。对带毒亲虾在室内隔离条件下进行了暂养催产,并对其所产的卵子、幼虫和的虾进行了隔离培育。带毒亲虾的卵子孵化率、幼虫成活率和幼虾生长速度均明显低于不带毒亲虾的子代。电镜观察发现．在带毒亲虾卵巢、各期幼虫和幼虾的细胞内存在球状病毒颗粒,在刚产的卵子的卵黄颗粒中可看到一种似球状病毒颗粒。研究表明：带球状病毒的对虾呈隐性感染,在胁迫条件下带毒幼虾可暴发病害,带毒亲虾可正常发育产卵,病毒可能通过卵巢、卵子进行垂直传播。     

一种改良的对虾白斑综合征病毒的提纯技术

The envelope proteins of White spot syndrome virus (WSSV) are very fragile and easy to be destroyed during purification. It was difficult to obtain a large quantity of intact virions by routine sucrose gradient centrifugation. After modifying the sucrose gradient by adding citrate sodium, we can obtain a large quantity of intact virions and nucleocapsids. This purified virions and nucleocapsids were subsequently used for analyzing viral structural proteins and DNA extraction. The result showed that this modified techniaue is very efficient for virus purification.     

两种病毒侵染中国对虾后细胞超微病理学变化与免疫标记

应用电子显微技术研究人工感染的中国对虾病毒病原及其宿主细胞超微病理学变化。结果显示病虾体内存在球状与杆状两种病毒病原,有时在同一病虾组织的同一细胞中可见两种病毒同时侵染现象,该现象提示存在复合感染的可能。利用胶体金免疫标记技术对感染病虾细胞质中出现的球状病毒作定位标记,初步结果表明已分离提纯的球状病毒与感染病虾细胞质中观察到的病毒粒子性质基本相同。病毒侵染后,细胞内主要的细胞器如线粒体、内质网、核糖体均发生了显著变化;侵染后期,可见溶酶体及多种膜性结构大量增生、细胞核被一些微管样结构包裹等特殊变化的发生。     

侵染半夏的两种病毒的分离纯化和初步鉴定

用自然感染的半夏（Ｐｉｎｅｌｌｉａｔｅｒｎａｔａ）为材料,经粗提纯后检查到一种线状病毒和一种球状病毒,用两种方法对担提纯样品中的病毒粒子进行了分离纯化。１０％－７０％连续甘油梯度８００００ｇ离心１５０分钟获得两条病毒带,经紫外吸收测定均为强的核蛋白吸收峰,病毒粒子检查分别为球状和线状病毒粒子,线状病毒经浓缩收集为均一成份．与芋花叶病毒（Ｄａｓｈｅｅｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ,ＤＭＶ）抗体有强的阳性反应。粗提纯样品经０．８％琼脂糖凝胶电脉分离为一条蛋白带,该条带回收后经紫外吸收测定为核蛋白吸收峰,电镜下检查为均一的球状病毒,以ＴＭＶ为对照、醋酸铀（ＵＡＣ）负染后测得该球状病毒（ｐｉｎｅｌｌｉａｓｐｈｅｒｉｃａｌｖｉｒｕｓ１．ＰｓＶ－１）的大小为３１．７ｎｍ;戊二醛固定后磷钨酸（ＰＴＡ）负染测得ＰｓＶ—１的大小为３４．０ｎｍ。各组分经ＳＤＳ－聚丙烯酸胺凝焦电泳分析测得线状病毒和球状病毒的外壳蛋白分子量分别为２０ＫＤ和２８ＫＤ。初步确定线状病毒为ＤＭＶ．球状病毒ＰｓＶ—１为侵梁天南星科半夏的一种新病毒。     

一株新型云南牛环状病毒的分离鉴定

【目的】为加深云南省动物虫媒病毒多样性的认知。【方法】在云南省景洪市设立哨兵牛,定期采血接种细胞进行虫媒病毒的分离;通过RT-PCR、电镜观察与基因组琼脂糖凝胶电泳对分离病毒进行初步鉴定;扩增分离病毒的基因节段2 (Seg-2)与基因节段3 (Seg-3)全长序列进行分析与系统发生树的构建,明确病毒的分类地位;通过qRT-PCR与血清中和试验对病毒在动物上的感染进行回溯分析。【结果】2019年7月,从哨兵牛上采集的血液中分离到1株可在BHK-21细胞上引起细胞病变的病毒;电镜下观察,病毒粒子呈球形,直径约70nm;琼脂糖凝胶电泳显示病毒基因组由双链RNA组成,呈现"3-3-3"的带型特征。分离毒株的Seg-2编码环状病毒属病毒保守的T2蛋白,与Mobuck virus具有最近的亲缘关系,核酸与氨基酸序列相似度分别为72.8%与84.0%;分离毒株的Seg-3编码决定环状病毒属病毒血清型的OC1蛋白,与Mobuckvirus的核酸与氨基酸序列相似度仅为60.2%与56.5%;在T2与OC1蛋白构建的系统发生树上,分离毒株形成独立于Mobuckvirus的进化分支。对哨兵牛血液中的病毒核酸与血清中和抗体回溯分析结果显示,从病毒感染哨兵动物至监测期结束的17周内,动物血液中均可检测到病毒核酸;动物感染病毒1周后,开始产生特异性中和抗体,随后上升至最高水平(抗体效价1:226),至监测期结束,中和抗体仍维持在较高水平(抗体效价1:113)。【结论】本研究首次报道了1种新型Mobuckvirus在云南省哨兵牛上的分离与感染特性。研究结果丰富了对我国环状病毒属病毒的认知,为开展病毒的诊断、流行病学与致病性研究奠定了基础。     

侵染莜麦的大麦黄矮病毒的分离及提纯

用液氮或低温冷冻染病组织及差速离心和葡聚糖凝胶过滤的方法,提纯了自然侵染莜麦的大麦黄矮病毒(BYDV)。电镜照片中病毒呈多面体结构,大小均一,平均直径为23.66±1.2nm,且聚集较多。将提纯的病毒以三种无毒蚜为介体,经薄膜饲毒法回接到华北二号莜麦上,表明提纯的病毒能引起类似田间病株的症状。     

上海地区小鼠诺瓦克病毒的检测分析及病毒分离

目的了解上海地区实验小鼠自然感染小鼠诺瓦克病毒(murine norovirus,MNV)的状况,并分离毒株。方法抽取委托检测单位送检的SPF小鼠319只,分别采集盲肠内容物及血液样本,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增小鼠盲肠内容物样本中MNV的特异性基因片段来检测MNV的感染情况,同时采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)与核酸检测方法进行对比。将RT-PCR扩增结果为阳性的盲肠内容物样本稀释并经0.22μm滤膜过滤,接种到小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞,盲传后采用RT-PCR方法鉴定。结果 RT-PCR检测的319份小鼠盲肠内容物样本中,阳性样本95份,阳性率为29.78%。对180份经RTPCR检测的小鼠血清进行ELISA检测,阳性样本70份,阳性率为38.89%。RAW 264.7细胞盲传5代后在72 h内出现细胞病变,经RT-PCR鉴定,显示187 bp的目的条带。结论通过核酸检测方法和血清学方法证实上海地区实验小鼠存在MNV自然感染,且感染率较高,应加强实验小鼠的饲养管理。     

皱纹盘鲍一种球形病毒的感染及其发生

在发病的皱纹盘鲍（HaliotisdiscushannaiIno）幼鲍的足、内脏团、外套膜的血细胞质内,发现一种直径为90～140um的球形病毒粒子,带双层囊膜,无包涵体。负染病毒粒子与超薄切片大小形态相同。用被病毒感染的患病幼鲍感染健康鲍获同样症状,死亡率为50％。并于人工感染死亡鲍鱼体内观察到同样病毒。     

无包涵体杆状病毒在中国对虾主要器官组织中的分布

研究自然发病和人工感染的中国对虾胃等10种器官组织内杯状病毒的分布情况,结果在病虾的胃、皮下组织、鳃、循环血细胞,肠的上皮和结缔组织细胞中,观察到大量病毒粒子,是该杆状病毒侵染的主要器官组织;在类淋巴、,肝脏、肝胰腺的组织细胞中,观察到中等数量的病毒粒子;在症状典型的病重虾腹神经索,肌肉组织细胞中观察到少量病毒粒子。表明病毒在病虾机体内广泛分布,已形成周身性感染。该病毒主要侵染以上器官的疏松结缔组织细胞、上皮细胞和循环血细胞,其次是神经胶质细胞和心肌细胞。在中国对虾的神经胶质细胞、心肌细胞、循环血细胞以及各主要器官的疏松结缔组织细胞中,目前尚未见到报道存在有杆状病毒粒子。     

10株水痘带状疱疹病毒的分离鉴定与生物学特性

用ＶｅｒｏＥ６细胞从１２例水痘及带状疱疹病人水疱液中分离到１０株病毒,分离阳性率为８３．３％。１０株病毒均具有使感染细胞圆缩、融合、脱落等典型的ＶＺＶ局灶性细胞病变（ＣＰＥ）特点,ＣＰＥ随着传代次数增加而加快。用带状疱疹恢复期病人血清作间接免疫荧光染色镜检,可见典型的感染细胞核内荧光块。１０株病毒感染细胞制成的抗原片,检测５例带状疱疹病人急性期及恢复期血清,荧光抗体滴度均有４倍以上增高。ＶＺＶ对Ｖｅｒｏ细胞敏感;对沙鼠肾,胎兔肾,胎豚鼠肾、肺、脾原代单层细胞不敏感;对乳小白鼠不敏感。毒种在－２０℃保存一周内死亡;但在３０％脱脂牛奶、２０％小牛血清及１０％山梨醇Ｅａｇｌｅ’ｓ液中,液体或真空冷冻干燥－１００℃可保存二年以上。     

中国对虾非包涵体杆状病毒在体内的感染与发生

在感染发病成虾的肝胰腺和中肠上皮细胞的胞核内,出现大量病毒发生基质,核衣壳,套膜和完全的病毒粒子。病毒粒子为短杆状,两端呈钝园形,平均大小约为２５０－３００×ｌ１０ｎｍ,在核内无包涵体形成。在胞质内发现伴随病毒拉子并具有双层膜的蛋白质结构,这种结构建议称为该病毒的“封入体”。同时,我们认为这种无包涵体的杆状病毒,有可能应归属于杆状病毒科的第三个亚组。     

风信子中抗青霉素内生菌的分离、筛选和活性检测

通过用初筛培养基培养,从风信子叶子中分离出一种抗青霉素的内生菌,进行离体培养和抑菌活性检测。结果表明所筛选的菌株的发酵产物对细菌和真菌均有一定的抑菌活性。其中发酵液提取物对枯草芽孢杆菌有一定的抑菌活性,对苹果干腐病原菌和烟草赤星病原菌的抑菌率分别是94.8%和93.8%,而菌体内的活性物对蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌都有较高的活性,对苹果干腐病原菌、烟草赤星病原菌和苹果轮纹病原菌的抑菌率都在80%以上。     

辽宁碱蓬胆碱单加氧酶(CMO)基因启动子分离及功能元件分析

根据已知的辽宁碱蓬CMO cDNA 5′端序列设计两个基因特异的反向引物(CR1,CR2),通过衔接头PCR获得了CMO基因起始密码子上游498 bp的序列。根据所获得的序列设计两个基因特异的反向引物(CR3,CR4),用CR2、CR3、CR4分别与4个简并引物配对,通过TAIL-PCR扩增,获得了约2 kb的序列。经Sequencer软件拼接上述两段序列,获得了CMO基因起始密码子上游2,332 bp的序列。用TSSP-TCM软件分析此序列,预测出转录起始点(C)位于起始密码子上游128 bp处,由此我们获得了2,204 bp的SlCMO启动子序列。用PLACE软件分析此序列,发现该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box,包含多个胁迫诱导元件,如盐诱导元件GAAAAA,冷胁迫诱导元件CANNTG,ABA 响应因子NAACAA,水胁迫元件CGGTTG和伤害诱导元件GTTAGGTTC等,是一个强的胁迫诱导启动子。辽宁碱蓬胆碱单加氧酶基因盐诱导启动子的获得,为盐诱导启动子功能元件分析提供了可能,为进一步研究启动子结构与功能的相互关系、CMO基因的表达调控机制奠定了基础。