Ⅰ～Ⅳ型登革病毒包膜蛋白B细胞中和表位的鉴定

登革病毒包膜蛋白(Dengue virus envelope protein,DENV E)是诱导中和抗体主要的蛋白,登革病毒包膜蛋白Ⅲ区(Dengue virus envelope protein domainⅢ,DENV EDⅢ)是构建DENV亚单位疫苗的主要靶标,但是其B细胞中和表位目前了解不多。我们采用两组覆盖DENV-1EDⅢ的重叠多肽(12肽和16肽)同27株针对DENV-1EDⅢ中和单抗反应,筛选DENV EDⅢ上B细胞表位。采用该方法,我们发现了一高度保守的Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位和一高度保守的DENV-1血清型特异性B细胞中和表位,分别位于DENV-1E蛋白氨基酸残基序列第309~320位和第381~392位(Amino acid residues 309~320,and 381~392;aa 309~320和381~392)。Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位在Ⅰ～Ⅳ型DENV分离株中存在高度保守共同序列310 KEVAETQHGT319,DENV-1E蛋白中E309、V312、A313和V320不影响蛋白抗原性。DENV-1血清型特异性B细胞中和表位(DENV-1E蛋白氨aa 381~392)在DENV-1分离株中高度保守,在黄病毒属其它病毒中不保守。我们也发现一具有DENV-1分离株特异性的B细胞中和表位位于DENV-1E蛋白氨基酸残基序列第329~348位。这些新发现的DENV-1E蛋白EDⅢ上B细胞中和表位可能有助于研制新的DENV亚单位疫苗。     

新型登革疫苗研究进展

登革病毒(Dengue virus,DENV)以伊蚊为主要传播媒介,可感染人,引起登革热(Dengue fever,DF)、登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)及登革休克综合征(Dengue shock syndrome,DSS),其中以登革热最常见,广泛流行于热带和亚     

登革病毒血清型特异单克隆抗体的制备和鉴定

登革病毒 (Dengue virus,DENV) 是全球传播最为广泛的虫媒病毒,由于缺乏快速鉴别感染病毒血清型的诊断技术,导致异型交叉感染引起重症登革出血热病例居高不下。为实现免疫学方法快速鉴别诊断不同血清型DENV感染,本研究采用哺乳动物细胞293T表达并纯化了4种DENV血清型NS1蛋白,免疫小鼠后通过杂交瘤技术制备了针对NS1蛋白的单克隆抗体。利用酶联免疫吸附方法 (Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、间接免疫荧光法 (Indirect immunofluorescence assay,IFA)、免疫斑点杂交试验 (Dot blotting) 以及蛋白质免疫印迹试验 (Western blotting) 确认所制备的单克隆抗体能够有效识别天然病毒NS1以及重组NS1蛋白。获得的单克隆抗体包含2株可识别1–4型DENV NS1蛋白的通用型抗体及3株分别针对DENV-1、DENV-2和DENV-4的血清型特异抗体。以所制备的DENV NS1抗体为基础,采用双抗体夹心ELISA可快速鉴别不同血清型DENV。DENV血清型特异单克隆抗体的制备和甄别DENV血清型ELISA方法的建立为快速鉴别感染DENV血清型的临床诊断奠定了基础。     

登革病毒流行株的分离鉴定及其毒力位点变异研究

目的:从登革热患者血清中分离登革病毒,鉴定流行株的血清型及其毒力。对其中两分离株E基因进行序列测定,分析其可能的毒力位点变异。方法:采集临床诊断为登革热患者急性期血清91份,接种于C6/36细胞分离病毒,应用间接免疫荧光法鉴定及分型。并通过乳鼠脑内接种和空斑试验,测定分离株的毒力。扩增2株分离株E基因,克隆到pGEM-T载体进行序列测定,分析变异位点。结果:在91份血清中经2~3次传代分离出8株病毒,鉴定为登革1型病毒。在E蛋白影响毒力的3个区段中,两分离株有3处存在变异。结论:推测此次广州地区流行登革热可能由DEN 1型病毒感染引起,流行株的毒力较弱。毒力减弱可能和其基因位点变异有关。     

衣壳蛋白靶向灭活策略应用于抗登革病毒感染的研究

衣壳蛋白靶向病毒灭活是近年来新兴的抗病毒策略。为探索该策略在抗登革病毒感染中的应用 ,首先建立了稳定表达登革 2型病毒衣壳蛋白 (D2C)与葡萄球菌核酸酶 (SN)融合蛋白D2C_SN的哺乳动物细胞系 ,然后以登革病毒攻击上述细胞系 ,研究表达的融合蛋白D2C_SN对产生的子代病毒颗粒感染性的影响。结果表明融合蛋白D2C_SN能够在病毒装配过程中与野生型衣壳蛋白共组装入子代病毒颗粒内部 ,并导致病毒基因组的降解。与正常BHK细胞相比较 ,融合蛋白D2C_SN可导致产生的子代病毒感染性滴度降低 10 3～ 10 4 ,显示出很强的抗病毒效果     

登革2型病毒衣壳蛋白在哺乳动物细胞中的表达与鉴定

从构建的重组质粒pLEX—C中高保真PCR获得编码登革2型病毒43株C基／E／（D2C）DNA片段,通过基因重组的方法将其克隆入真核表达载体pcDNA6／V5-His获得了重组真核表达载体pc／D2C。经电穿孔的方法转染BHK21细胞后,分别通过RT—PCR、免疫荧光和western印迹鉴定表达的蛋白。结果重组蛋白在BHK21细胞中获得表达,表达的蛋自主要存在于胞浆中,并具有较好的抗原性,能够被抗登革病毒衣壳蛋白单克隆抗体特异识别。此研究为深入了解登革病毒衣壳蛋白在病毒复制及组装过程中的生物学功能奠定了基础。     

埃及伊蚊对登革Ⅱ型病毒感染Balb/C实验小鼠的增强

以Balb/C小鼠为实验动物,探讨了埃及伊蚊Aedes aegypti唾液对登革病毒感染宿主的影响。结果显示,在皮下接种剂量相同的情况下,如果Balb/C实验小鼠预先被一定数量的埃及伊蚊叮咬以后,实验小鼠感染病毒的程度有所提高,血清中的抗体滴度明显降低,腹腔巨噬细胞感染登革病毒的阳性率及感染的时间动态曲线也有明显差异,感染高峰期延迟。这些说明实验小鼠被媒介蚊虫叮咬以后变得相对容易被登革病毒感染,可能是媒介蚊虫叮咬小鼠时分泌的唾液对宿主的免疫反应系统有一定作用。因此可以初步肯定埃及伊蚊在登革病毒的感染传播过程中,影响了Balb/C实验小鼠的免疫功能,对登革病毒的感染有一定推动作用。     

我国两株登革2型病毒基因组的全序列分析

本研究对我国两株登革2型病毒D2-43株、D2-04株的基因组进行了全序列测定,在此基础上对这两株引起不同临床症状及鼠神经毒力的登革病毒的基因组序列进行了比较分析,结果表明D2 43株与D2-04株基因组全长约为10 723nt,核苷酸序列的同源性为95.1%,氨基酸序列的同源性为97 6%,不存在特别的高变区.这两株序列中共有83个核苷酸的变化导致了氨基酸的变化,其中21个差异氨基酸可引起所在位点电荷或极性的变化,位于登革病毒粒子表面的E糖蛋白第126位氨基酸由Glu(D2-04株)→Lys(D2-43株)的变化对其抗原性有影响,可能引起了病毒对鼠神经毒力的改变.对结构糖蛋白E基因的聚类分析表明D2-43株与新几内亚株、台湾87株及菲律宾83株亲缘关系较近,D2-04株与牙买加株及巴西90年分离株的亲缘关系较近,表明我国存在不同起源的登革2型病毒感染.     

登革病毒疫苗研究现状与展望

登革病毒是属于黄病毒科的小型包膜病毒,在热带和亚热带地区通过蚊媒传播。其感染可引起临床症状轻微的登革热,甚至危及生命的登革出血热和登革休克综合征。登革病毒包含4种血清型,有效的登革病毒疫苗需对4种血清型的登革病毒均具有抗病毒保护作用。目前,尚未有针对登革病毒的特效药和成熟的疫苗产品。各类登革病毒疫苗均在研发中,其中一些已进入临床试验阶段。本文就登革病毒疫苗研究进展作一综述并对未来发展进行展望。