粪便学在有蹄类动物数量调查研究中的应用与展望

随着与分子生物学的结合,传统的粪便学不仅拓宽了在种群生态学、行为生态学及保护遗传学等研究时取样的范围,而且能提供更多的有效信息,使得传统的粪便计数方法得以在新的领域里发展。本文对传统粪便学在有蹄类动物数量研究中的应用加以总结,并结合国内外研究现状对分子粪便学在这一领域内的可靠性、局限性及应用前景做了概述。     

圈养普氏野马食石子报道

2003年7～12月在新疆野马繁殖研究中心,进行圈养普氏野马（Equus przewalskii）体内寄生虫种类和数量的调查与研究工作。在研究过程中,需要收集大量野马新鲜粪便,用于对寄生在野马消化道内寄生虫的研究。2003年8月,在所收集到的粪样中发现,有两个粪样中有大量的石子出现,这两个粪样分别来自于两个不同的饲养场地。其中一个粪样中石子数为58粒,另一个粪样中石子数为23粒。石子的粒径在5—8mm之间。通过粪球的大小可以断定,两份粪样都是亚成体的。这些石子在粪便内部或镶嵌在粪便上,被粪球包裹着,通过石子的数量和在粪球中的位置可以判断,这些石子不是排便落地后粘到粪便上,而是从野马体内排出。由于在一次排便中集中出现,所以可以断定,粪便中的石子不是由于野马误食石子的结果,而应该是野马在短时间内集中主动的取食石子造成。同时我们还做了一个饲喂实验,在碎草中掺杂大量的石子,石子的粒径与野马粪便中发现的石子粒径大小相当,野马采食前与采食后,两次对石子称重,结果显示,石子的重量变化范围在1g左右,这也证明野马不会误食如此多的石子。由于相隔一天,在两个不同的圈舍中发现相同的现象,所以可以断定圈养野马群体内的食石子不是个别现象。     

新疆塔里木马鹿粪便激素含量季节性变化的初步研究

目的:检测雄性塔里木马鹿的睾酮,雌鹿的雌二醇、雌三醇、孕酮等粪便激素含量,并比较不同月份之间的变化。方法:利用放射免疫分析法(RIA)在且末和尉犁县马鹿场采集塔里木马鹿粪便,检测了2004年2～12月间塔里木马鹿粪便中的激素水平。结果:粪便性激素水平有明显的季节变化(P<0.05)。雄鹿粪便睾酮水平月间差异显著(P<0.05),浓度在8月有2个高峰。雌鹿粪便雌二醇在3月和6月有2个高峰;粪便孕酮水平在3月有2个高峰,在8月有1个高峰;雌三醇差异不显著,但4月的最高值也显著高于其他各时间点(P<0.05)。结论:利用动物粪便研究激素具有对保护动物完全无伤害、材料收集容易等优点,并且有助于评估动物青春期的健康状况、判断动物排卵方式、早孕检查、产前预测等,因而是目前研究野生珍稀动物性激素的一种较为理想的方法。     

圈养雄獐领域行为和粪便睾酮水平变化的关系

2011年8月到2012年4月间,在上海市浦东新区华夏公园獐重引入试点,采用目标取样、扫描取样和全事件记录法,对圈养条件下6只成体雄獐(Hydropotes inermis)的6种领域行为进行观察,并利用放射免疫分析法(RIA)测定雄獐粪便中的睾酮水平变化.结果表明,雄獐的许多领域行为发生频次表现出明显的月间变化,包括打斗、威胁、取代、追逐和粪尿标记;擦额标记行为频次虽月间差异不显著,但与其他领域行为一样在11月份出现频次峰值.发情期(2011年10月～2012年1月)和非发情期(2011年9月、2012年2～4月),打斗、威胁、粪尿标记和擦额标记行为发生频次差异显著;取代和追逐行为频次差异不显著.6种领域行为的发生频次均在发情期明显高于非发情期.粪便睾酮含量在发情期和非发情期差异显著,发情期明显高于非发情期,其含量在12月份达到峰值(51.16±9.85) ng/g.雄獐的威胁、擦额标记、粪尿标记和打斗行为发生频次与睾酮水平呈显著的正相关性,而取代和追逐行为与睾酮水平变化不具有显著相关性.     

禽畜养殖粪便中多重抗生素抗性细菌研究

通过对新乡地区8家养猪场和11家养鸡场饲喂抗生素情况的调研,发现头孢氨苄、阿莫西林、卡那霉素、庆大霉素等4种抗生素是该地区被普遍使用的兽药抗生素。通过多点取样法和微生物培养技术对3家养鸡场和3家养猪场不同养殖时期的粪便进行单一抗生素和多重抗生素抗性细菌的检测,结果表明养鸡场堆置1周的粪便中抗头孢氨苄的细菌比例最高,达到65.90%,对所研究的3种和4种抗生素同时抗性的比例高达8.60%—12.51%和9.73%,明显高于饲喂中药的对照养鸡场样本检测结果(0.02%—2.73%和0.12%)。养猪场堆置1周的粪便中检测到抗头孢氨苄的细菌比例也是最高,达到49.12%上,但养猪场粪便中多重抗生素抗性细菌的比例明显低于养鸡场。同时研究发现,在两种养殖场中,幼龄期粪便中检测到的多重抗性细菌比例明显高于成熟期粪便,这可能与养殖过程中鸡、猪在幼龄期由于防病和促生长等因素而同时大剂量使用多种抗生素有关。     

基于PCR DGGE的小鼠肠道菌群基因组提取方法的建立

通过比较4种小鼠粪便细菌总DNA提取方法对基于PCR-DGGE检测的肠道菌群多样性分析的影响,旨在建立适于PCR—DGGE的小鼠肠道微生物宏基因组提取的稳定、经济、快捷的方法。采用SDS裂解法、某国产市售粪便DNA提取试剂盒、改进的化学裂解法、改进的溶菌酶法4种方法提取小鼠粪便细菌总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法、细菌16S rRNAV3区PCR扩增结合DGGE对提取结果进行比较分析。SDS裂解法和国产市售试剂盒2种方法提取粪便细菌总DNA均未得到理想结果,另2种方法均能够检测到粪便中20种左右的细菌。改进的化学裂解法和改进的溶菌酶提取法的建立为基于PCR—DGGE进行肠道菌群结构的定量及定性分析提供了可靠的前提基础和实验保障。     

人工养殖条件下三种锦蛇的粪便微生物多样性

采用高通量测序技术,分析比较了实验室人工饲养的王锦蛇(Elaphecarinata)、棕黑锦蛇(E.schrenckii)和赤峰锦蛇(E. anomala)3种锦蛇粪便样本的微生物多样性。结果显示,在送检的粪便样本中,Shannon多样性指数(P 0.05)和Simpson多样性指数(P 0.05)在王锦蛇和棕黑锦蛇之间有显著性差异,赤峰锦蛇与前两者均没有差异;ace与chao1指数在3种锦蛇之间没有显著性差异。共检测出8个菌门,厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)是3种锦蛇共享菌门。在属水平上3种锦蛇的优势菌群明显不同,志贺氏菌属(Shigella)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium_sensu_stricto_11)及拟杆菌属(Bacteroides)分别是王锦蛇、棕黑锦蛇和赤峰锦蛇粪便样本中相对丰度最高的菌属。3种锦蛇粪便微生物多样性存在着明显的差异,但其是否可以作为区分这3种锦蛇的依据还需要进一步研究。     

鄱阳湖越冬白鹤在农业用地的食物组成

白鹤(Grus leucogeranus)是IUCN极危物种,全球仅存3 500～4 000只,其中约98%的个体在鄱阳湖越冬。以前白鹤在鄱阳湖主要在浅水生境挖掘苦草(Vallisneria spp.)的冬芽为食。然而,近年来农业用地已成为白鹤的重要觅食地。目前对于白鹤在农业用地的食物组成尚不清楚。本研究采用粪便显微镜检法对2017年11月至2018年4月采集的70份白鹤粪便样品进行分析。结果表明,白鹤的食物来源于10科15种植物,其中,水稻(Oryza sativa)、莲藕(Nelumbo nucifera)和紫云英(Astragalus sinicus)为最主要的食物,这3种植物在检测到的食物中的相对密度分别为34.34%、22.99%和10.61%,而白鹤的传统食物苦草冬芽所占的比例极低(2.05%)。由此可见,白鹤的食物组成已经发生变化,农作物已成为白鹤的重要食物来源。白鹤在农业用地中觅食使该物种的保护面临一系列问题,尤其是高强度的人为干扰,对此,提出了相应的保护措施,希望为白鹤提供安全、稳定的觅食环境。     

滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶基因的表达及酶学性质

【目的】对滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶进行异源表达和纯化,并研究其酶学性质。【方法】从滇金丝猴粪便微生物的宏基因组中克隆出一个β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,对该基因进行异源表达和酶学性质分析。构建含有T7强启动子的pEASY-E2-galRBM20_1质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行酶学性质研究。【结果】滇金丝猴粪便来源的β-半乳糖苷酶(galRBM20_1)最适pH为5.0,在pH 4–7之间能保留70%及其以上的活性。最适温度为45°C,在37°C和45°C下耐受1 h,酶活不变。特别的是,该酶具有良好的Na Cl稳定性,经1–5 mol/L的Na Cl作用1 h后,相对酶活均能超过初始酶活:当NaCl的作用浓度为4 mol/L时,β-半乳糖苷酶相对酶活最高(146%);当NaCl的作用浓度为5mol/L时,β-半乳糖苷酶的相对酶活仍达到135%。【结论】本研究从滇金丝猴粪便微生物的宏基因库中克隆得到β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,并成功在大肠杆菌BL21(DE3)表达,首次从动物胃肠道宏基因组中获得具有耐盐和转糖基产Galactooligosaccharides(GOS)性能的β-半乳糖苷酶。该酶具有良好的耐盐性,和较广的pH作用范围,使其在食品、生物技术领域和环保方面的发展具有良好的应用价值。     

泌乳期、干奶期的娟姗牛和荷斯坦牛粪便菌群组成及纤维素降解功能CSCD

目的 探讨泌乳期、干奶期反刍动物粪便的纤维素降解能力和菌群变化。方法 采集娟姗牛和荷斯坦牛泌乳期、干奶期的粪便,通过滤纸崩解实验分析牛粪纤维素降解能力,利用二代测序技术观察泌乳期和干奶期牛粪在滤纸崩解实验前后粪便菌群的结构变化。结果 滤纸崩解实验发现,娟姗牛泌乳期和干奶期粪便菌群纤维素降解能力无显著差异,而荷斯坦牛干奶期粪便菌群纤维素降解能力显著强于泌乳期。二代测序结果表明,荷斯坦牛在干奶期时粪便菌群alpha多样性低于泌乳期,而滤纸崩解后2种牛的粪便菌群alpha多样性均显著升高,且荷斯坦牛干奶期粪便菌群的alpha多样性高于泌乳期;Beta多样性分析显示同种牛在泌乳期和干奶期粪便菌群结构有显著差异。滤纸崩解前2种牛泌乳期和干奶期粪便菌群均以Proteobacteria为优势菌门,但在滤纸崩解后泌乳期和干奶期粪便菌群均以Bacteroidota和Firmicutes为优势菌门。滤纸崩解后,2种牛泌乳期和干奶期粪便菌群属水平组成相似,均以Rikenellaceae＿RC9＿gut＿group、UCG-005、Christensenellaceae＿R-7＿group和UCG-010为优势菌属,且粪便菌群结构趋同。结论 干奶期荷斯坦牛粪便的纤维素分解效果显著。在反刍动物粪便样本中进行纤维素降解功能菌分离筛选时,应于动物干奶期进行自然样本的集中采集。