《中国药典》中标准菌种质控新方法的研究

目的 研究《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)纳入的标准菌种质控新方法,并评价不同批号标准菌种的质量稳定性。方法 对脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术进行比较研究,同时整合16SrRNA基因序列分析、多位点序列分型和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等质控新方法,进行标准菌种质控新方法的建立,并对标准菌种的质量进行评价。结果 形成了适用于《中国药典》中标准菌种的方法,并通过整合的质控新方法对不同批号的标准菌种进行评价,结果显示,菌种质量稳定,遗传信息无改变。同时,建立了标准菌种16SrRNA基因标准序列、PFGE标准指纹图谱和标准基因型。结论 标准菌种质控新方法的研究,为更加全面、深入地评价标准菌种的质量提供了依据;建立的标准菌种质量控制体系及标准菌种质控鉴定信息,为标准菌种持续的质量控制奠定了重要的参比信息基础。     

DNA测序仪应用性相关指标初探

DNA测序仪是目前法医DNA检验技术的重要检验仪器,目前尚无文献有关DNA测序仪应用性能指标的报道。本文根据以往的实验经验和现有的文献资料,针对自主研制的DNA测序仪提出了几个判定仪器应用性能的指标,以期为DNA测序仪的整体性能测试,后续研发和扩大生产提供可参考的建议。     

乡村沼气池污泥微生物多样性的研究

为了优化沼气池产气效率和开展污泥微生物多样性研究,通过对PCR-DGGE条件的优化,建立了农村户用沼气池污泥微生物16S r DNA V3区DGGE分析技术,通过DGGE技术分析了沼气池污泥中细菌和古细菌微生物多样性随沼气池深度的变化规律。同时通过构建污泥样品mcr A功能基因克隆文库,应用RFLP技术,开展了农村户用沼气池污泥样品中与次级代谢产物相关基因的功能基因多样性研究。结果显示,农村户用沼气池污泥中含有丰富的微生物资源,其中细菌群落受污泥深度因素影响小,而浅层污泥中古细菌群落与深层污泥中古菌群落却存在明显差异。所采集的沼气池污泥中含有较为丰富的产甲烷菌资源,其中可能存在类似功能或产生类似代谢物质的产甲烷菌。该结果为进一步优化群落结构、筛选功能基因提供了科学依据。     

橘小实蝇成虫肠道可培养细菌群落结构分析

【目的】研究橘小实蝇(Bactrocera dorsalis) 3个种群(实验室正常喂养种群、实验室无菌糖水喂养种群和野生种群)成虫肠道可培养细菌的群落结构组成。【方法】利用16S rRNA基因的聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)分析技术,结合菌落形态观察和生理生化特征鉴定细菌种类。【结果】从橘小实蝇3个种群成虫肠道600株可培养细菌得到53种不同细菌遗传型,分属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)和芽孢杆菌科(Bacillaceae)等3个科。其中肠杆菌科是肠道可培养细菌最优势的细菌种类。同样以序列相似性大于97%的菌株归为相同的细菌种类为标准,找到了橘小实蝇3个种群可培养细菌的共有菌种,结合菌落形态观察和生理生化特征鉴定,确定共有菌种为肠杆菌属5株,克雷伯氏菌属2株,柠檬酸杆菌属1株,泛菌属1株,肠球菌属2株,以及芽孢杆菌属4株。【结论】通过研究橘小实蝇成虫肠道可培养细菌群落结构组成,可为探讨肠道菌群对寄主的生理功能和生态学意义奠定基础,最终为利用微生物防治此类害虫提供新思路。     

仔猪结肠中产甲烷菌群多样性及其与环境因子的相关性

【目的】为评价仔猪结肠中产甲烷菌群多样性及其与环境因子(日粮类型、断奶应激及日龄)的相关性。【方法】分别采集了7、14、21、24和35日龄仔猪结肠内容物,进行基因组总DNA的提取,运用变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术分析各结肠样总DNA的产甲烷菌的PCR产物,同时研究了与甲烷生成相关的结肠内挥发性脂肪酸(Volatile fatty acid,VFA)的变化情况。【结果】结果表明,仔猪结肠内容物中乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸(Total volatile fatty acid,TVFA)浓度随日龄增加而显著升高(P<0.05),但丁酸浓度未有显著性变化(P>0.05);基于Dice模式的UPGMA聚类分析的DGGE指纹图谱结果显示,7-24日龄结肠样的产甲烷菌群落结构相似性较高,聚集到一个分支上;而35日龄的结肠样聚集到另一分支上;冗余分析(Redundancy analysis,RDA)结果表明,日龄和日粮类型与产甲烷菌群落结构的关联度较高;序列分析表明,仔猪结肠食糜中甲烷菌群主要以甲烷短杆菌为主,同时存在另一类未知甲烷菌。【结论】本研究表明,甲烷短杆菌是仔猪结肠中的优势产甲烷菌,日龄和日粮类型与仔猪结肠中产甲烷菌群落结构的相关性最强。     

利用PCR-DGGE方法分析不同鸡群的盲肠微生物菌群结构变化

研究不同品种、饲养阶段的健康和不良鸡群对盲肠细菌种群结构和多样性的影响。使用基于16S rDNA的PCR-DGGE技术,结合割胶回收DNA进行克隆和测序,分别以4、6、10、16、20、40周龄蛋鸡及1、2、4、6、7、8周龄肉鸡健康、不良鸡群盲肠内容物为样本,研究其中特定细菌类群的16S rDNA序列片段指纹图谱,并进行聚类分析,鉴定特异性和共性种群。在两品种健康鸡群盲肠内容物的细菌群落中,Lactobacillus属菌株的相似性均高于不良鸡群,并且在不同饲养阶段的健康、不良鸡群间指纹图谱平均条带数差异显著(P<0.05);而Bacteroides属菌株在健康鸡群盲肠内容物细菌的相似性与不良鸡群较为相近,健康、不良鸡群间平均条带数差异显著(P<0.05);Clostridium属菌株在蛋鸡20、40周龄的平均条带数差异不显著(P>0.05),但肉鸡各周龄健康、不良鸡群间的平均条带数差异显著(P<0.05)。序列测序结果,在蛋鸡产蛋期健康、不良鸡群样本中均检测到能动乳杆菌(Lactobacillus agilis),而育雏和育成期中均检测到鸟乳杆菌(Lactobacillus aviaries)和不可培养细菌;两品种的健康、不良鸡群样本中均检测到Bacteroides属的生酸拟杆菌(Bacteroides acidifaciens)、不可培养物细菌(Uncultured bacterium);而健康、不良蛋鸡群样本中均检测到Clostridium属不可培养的变形菌(Uncultured proteobacterium),健康肉鸡群中检测到索氏志贺菌(Shigella sonnei),而两品种不良鸡群中均缺乏此类菌种。结果显示,不同品种、饲养阶段的鸡群,其盲肠细菌群落的组成差异显著,并且细菌种群结构对鸡群的生长发育影响较大。     

Presenilin-1/Presenilin-2双基因敲除小鼠脑中单胺类神经递质变化的研究

条件性presenilins双基因敲除小鼠(dKO小鼠)表现出类似阿尔茨海默症(AD)的大部分神经退行性病症,如Tau 蛋白磷酸化、神经元凋亡、皮层萎缩以及认知能力受损等．为探讨presenilins功能缺失、神经退行性症状与单胺类递质变化的相关性,利用毛细管电泳法检测6、9和12月龄dKO小鼠皮层、海马及其他前脑部位中各单胺类神经递质的含量．结果显示,与对照组相比,dKO小鼠皮层中单胺类神经递质在6月龄时显著降低,而随着年龄的增长,神经退行性病变加剧,递质浓度也均明显上升,在海马区,dKO小鼠单胺类递质则呈上升趋势,但仅6月龄时5-羟色胺和肾上腺素及12月龄时各递质的上升有统计学意义,前脑其他部位5-羟色胺和多巴胺递质在6、9月龄时与对照组相近,在12月龄时则显著降低,而去甲肾上腺素和肾上腺素在6月和12月龄时均呈降低趋势,且均有统计学差异(6月龄肾上腺素除外)．实验表明,单胺类神经递质在presenilins双基因敲除的小鼠前脑各区域中的水平均发生了随龄化的变化,且在前脑皮层、海马与前脑其他区域的变化趋势各有不同,而单胺类递质的变化是presenilins双基因敲除导致的直接结果还是间接结果,单胺类递质在AD样神经退性行病变中的作用如何,还有待于进一步的研究．     

Viili中益生菌的分离及其发酵性质研究

目的 利用传统方法和分子生物学方法从viili中筛菌并对其特性进行研究.方法 采用MRS、YPD和脱脂乳营养琼脂3种平板从viili中分离出15株单菌,利用V3区通用引物和乳杆菌特异性引物对各单菌的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)分析,将其归为5种不同菌.结果 16S DNA测序表明,5种单菌分别为Lactobacillus plantarum、Streptococcus thermophilus、Lactobacillus paracasei、Bacillus cereus和Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.混合发酵实验表明:从viili中筛出的5种菌除Bacillus cereus外均有凝乳现象,其中Lactobacillus delbrueckii凝乳能力强,可在5 h内凝乳;Lactobacillus paracasei、Bacillus cereus和Lactobacillus plantarum组合产生的EPS量最多,高达186.71 mg/L,而Streptococcus thermophilus EPS产量仅为33.56 mg/L.结论 传统方法与分子生物学方法DGGE相结合,可以快速准确判断细菌种类;筛选菌特性研究结果表明,细菌之间的相互作用导致凝乳时间和EPS产量发生变化,其复合作用有待于进一步研究.     

人工神经原网络处理PCR数据在细菌鉴定中的应用

目的16SrRNA和16S-23SrRNA间区片段是常用细菌分类鉴定靶点,本研究探讨人工神经原网络（ANN）对上述位点PCR扩增产物数据分析在细菌快速鉴定方面的价值。方法2对15SrRNA基因荧光引物和1对16S-23SrRNA区间基因引物用于扩增血液标本中分离出的317株细菌。相关毛细管电泳（CE）限制性片段长度多态性（RFLP）和单链构象多态性（SSCP）数据进行人工神经原网络分析。结果16S-23SrRNA基因的RFLP数据对未知菌鉴定的准确率高于16SrRNA基因的SSCP数据,分别为98．0％和79．6％。结论实验证明了人工神经原网络作为一种模式识别方法对于简化细菌鉴定十分有价值。