神奇的噬菌体与基因工程

基因工程的研究人员正通过遗传密码的研究和使用,使得他们有机会深入到人们的内心深处,并给他们提供了操纵生命的工具,研究人员正准备将基因工程技术推进到更富挑战性的领域。     

肿瘤特异性蛋白B7-H4纳米抗体的筛选和鉴定

羊驼体内存在天然缺少轻链的重链抗体,克隆重链抗体可变区(VHH),即可构建单域抗体(single-domain antibodies,sdAbs),又称纳米抗体(nanobody,Nb)。利用非免疫羊驼噬菌体文库筛选肿瘤特异性蛋白B7-H4的纳米抗体,经过4轮淘选,ELASE鉴定阳性克隆噬菌体,测序获得其DNA序列后体外转录为mRNA,将修饰纯化后的mRNA转染到肿瘤细胞,利用细胞免疫荧光检测mRNA在肿瘤细胞内是否表达,Western印迹进一步验证其表达情况;通过CCK-8法鉴定其对肿瘤细胞的增殖抑制能力;划痕实验鉴定其对肿瘤细胞迁移能力的影响;Transwell法鉴定其对肿瘤细胞的侵袭能力的影响;裸鼠荷瘤模型瘤旁注射mRNA,鉴定其在体内实验对肿瘤组织的作用。结果显示,通过淘选获得1个高亲和性的噬菌体株菌H6;DNA测序并导出的氨基酸序列符合羊驼纳米抗体结构;将其mRNA导入肿瘤细胞,能有效表达出纳米抗体H6;转染H6-mRNA的肿瘤细胞(0.84±0.08)与未转染H6-mRNA的对照组(1.83±0.04)相比,其增殖能力明显受到抑制,P<0.01,其迁移和侵袭能力(78.60±5.36)明显低于空白对照组(197.80±21.04),效果优于B7-H4 mRNA的siRNA(95.40±16.56);在裸鼠乳腺癌模型中能有效抑制肿瘤生长,效果优于紫杉醇和B7-H4 mRNA的siRNA。这说明筛选所得抗B7-H4纳米抗体H6能特异结合B7-H4蛋白并封闭其功能,导致肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭受到抑制。该结果为利用B7-H4作为治疗癌症的靶点提供了实验基础。     

云南药用野生稻核基因组细菌人工染色体(BAC)文库的构建与分析

通过云南药用野生稻核基因组BAC文库的构建,保存处于濒危状态的云南药用野生稻遗传资源,该文库包含27 500个克隆,随机挑取80个克隆检测,插入片段平均大小为80kb,文库容量相当于水稻基因大小的5.1倍。     

焦化废水处理厂接触氧化池中降酚菌群的苯酚羟化酶大亚基基因多样性

研究了某焦化废水处理厂接触氧化池中降酚菌群的苯酚羟化酶大亚基基因(thelargestsubunitofthemulti-componentphenolhydroxylase,LmPH)的多样性。通过温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)对比分析了氧化池4个区段(O1—O4)中降酚菌群LmPH的组成。它们的TGGE图谱完全一样,相似性为100%,表明该处理池中不同区段的降酚菌群的功能基因组成是高度相似的。以O4段的菌群为代表建立LmPH基因克隆文库,从中挑选了49个克隆测序。依据LmPH基因的DNA序列所推测的氨基酸序列完全相同的归为一类的原则,49个克隆被分为16种类型,其中优势LmPH基因主要有5种类型(多于4个克隆),而另外11种类型都只有1个克隆。与已知基因同源性超过90%的有7种类型,低于80%的有2种类型。基于氨基酸序列的系统进化树分析表明,LmPH文库中绝大部分的类型都属于低亲和常数(low-Ks)的LmPH,占所有克隆的92%。只有一个类型属于高亲和常数(high-Ks)的。因此,处理焦化废水的工业装置中不仅具有丰富多样的苯酚羟化酶基因类型,而且以编码低亲和常数的占优势地位,而过去报道的通过富集培养分离得到的降酚菌则多带有高亲和常数的酶。这提示我们传统的富集培养方法并不能筛选到生态环境中的真正优势功能菌。     

以重组TACE胞外功能域从噬菌体随机肽库中筛选TACE的抑制肽

肿瘤坏死因子转换酶 (TACE)是加工裂解TNF-α前体的关键酶 ,参与了许多炎症的发生发展过程。为通过肽库筛选得到TACE的抑制肽 ,首先制备筛选靶分子 ,用RT PCR从人外周血单核细胞中分别扩增出TACE的催化区 (T800 )和整个胞外区 (T1300 ) ,然后分别克隆至pET-28a和pET-28c中 ,转化大肠杆菌BL2-1(DE3) ,经IPTG诱导表达出带有His-tag的目的蛋白 ,两者均为包涵体 ,变性复性后过Ni²⁺-NTA亲和层析柱得到纯度达90%的重组蛋白。以纯化的重组T800和T1300分别筛选噬菌体展示随机 15肽库 ,对筛选克隆进行ELISA检测、竞争抑制实验和序列分析。从两个独立的筛选过程中得到一个相同的阳性克隆序列“TRWLVYFSRPYLVAT” ,固相Fmoc法合成该短肽 ,观察其在LPS诱导人单核细胞产生sTNF-α中的作用。结果表明 ,筛选到的短肽可显著抑制TACE的活性 ,减少TNF-α的分泌 ,抑制率可达 60.3% ,为抗炎小分子药物的设计和改造提供线索和依据。     

噬菌体整合酶介导的位点特异性基因治疗

将治疗基因整合到患染色体上的特定位点并实现稳定的表达是基因治疗的关键,包括病毒载体和转座子系统在内的几种技术已经用于整合,但都存在治疗基因负载力较小及随机整合的应用障碍。来自链霉菌噬菌体中C31、R4及来自乳酸乳球菌噬菌体TP901-1的整合酶,能够识别有限数量的天然基因组序列(假att位点)．从而催化治疗基因位点特异性地整合进入高等真核生物基因组。这种新型的噬菌体整合酶系统在基因负载力及染色体的特异性整合方面具有很大的优越性。迄今为止,这种系统已经成功用于几种基因治疗的研究模型中．将会成为基因治疗的有用工具。     

分枝杆菌噬菌体生物学特性探讨

为了确定不同分枝杆菌噬菌体的宿主菌以及扩增方法和最佳保存方法,观察了七种分枝杆菌噬菌体对结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌的裂解情况,并分别于感染后 24、48小时采用离心 过滤、孵育 过滤方法收集噬菌体比较扩增效率,采用不同稳定剂对分枝杆菌噬菌体进行液体和冻干保存,在不同时间段采用琼脂双层法检测其效价。结果显示:①D29分枝杆菌噬菌体能同时较高效地裂解结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌;②感染 48小时后采用孵育 过滤方法收集的噬菌体效价高,方法简单;③液体 4℃保存的噬菌体稳定性好, 70℃液体保存和冻干后 4℃、室温、37℃保存依据不同稳定剂而相差较大。因此,在 48小时后采用孵育 过滤方法收集噬菌体具有高效率特性并且简单易行,噬菌体液体 4℃保存简单、有效,值得推荐。     

双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞差减cDNA文库的构建

以紫外线灭活的dsRNA病毒草鱼出血病病毒(GCHV)诱导和模拟诱导的牙鲆胚胎细胞为材料,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,成功构建了双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞(FEC)差减cDNA文库.以管家基因α-tublin作为差减指标,经检测,该文库差减效率达2 10倍,表明经病毒诱导后某些差异表达基因也得到了相应倍数的富集.将获得的cDNA片段连接到pGEM-T载体,PCR检测显示差减片段在250bp～2 000bp之间.该差减cDNA文库的构建为从分子水平研究牙鲆培养细胞对dsRNA病毒的免疫反应、以及进一步鉴定和克隆差异表达基因打下了坚实基础.