虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ cDNA克隆及序列

 从中国珍稀毒蛛种虎纹捕鸟蛛 (Selenocosmia huwena)毒腺中分离纯化的虎纹捕鸟蛛毒素 - (Huwentoxin ,HWTX- ) ,其一级结构、二级结构和溶液构象均已阐明 ,生理功能实验已证实 HWTX- 是一种作用于突触前膜的神经毒素和高阈值钙通道抑制剂 .为深入开展对 HWTX- 的应用研究 ,根据 HWTX- 多肽氨基酸序列 ,设计其 N-端、C-端和中间段 3组简并引物 (引物 、引物 和引物 ) .从虎纹捕鸟蛛毒腺提取制备 m RNA,逆转录合成 c DNA.以引物 和引物 为引物 ,采用 PCR方法对虎纹捕鸟蛛毒腺总 c DNA进行简并引物扩增 ,得到两条相对特异性的 DNA片段 ,产物直接与 PCR克隆载体 p UC- T连接 .重组子经原引物再次 PCR扩增和同位素标记引物 进行 Southern分子杂交鉴定 .对 4个重组子测序结果表明 ,有 1个重组子所对应的氨基酸顺序与 HWTX- 一致 ,Gen Bank数据检索说明 HWTX- c DNA编码序列确实是一个从未报道的序列 .本研究结果为 HWTX- 在真核细胞表达 ,大量获取蜘蛛毒素组分奠定了基础 .     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ突变体A1Y-HWTX-Ⅰ的固相合成和生物学活性测定

用芴甲氧羰基 (Fmoc)固相多肽合成的方法在自制自动蛋白质化学工作站上合成了用酪氨酸 (Y)替代虎纹捕鸟蛛毒素 - (HWTX- )第一位丙氨酸 (A1 )的突变体 A1 Y- HWTX- .合成的突变体用 Edman降解和电喷雾质谱法进行鉴定 .活性分析结果证明 ,合成的 A1 Y- HWTX- 在含有谷胱甘肽的缓冲体系中氧化折叠后显示出与天然 HWTX- 完全相同的生物学活性 ,提示 Y替代 HWTX- 的 A1后并不明显影响 HWTX- 的活性部位和空间构象 ;A1与 HWTX- 生物学活性无关 .此外 ,将 Y引入 HWTX- 分子有助于利用碘标记方法研究 HWTX- 的作用机制     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ-(HWTX-Ⅰ)28肽类似物的化学合成与活性鉴定

虎纹捕鸟蛛毒素-(huwentoxin-,HWTX-)是从我国虎纹捕鸟蛛毒素中分离纯化得到的一种多肽类神经毒素.该多肽分子由33个氨基酸残基组成,含三对二硫键.其一级结构和三级结构均已测定.弄清该毒素的活性部位,是研究其结构功能关系的基础.用固相Fmoc化学合成的方法,合成了虎纹捕鸟蛛-的28肽类似物.该突变体去掉了天然毒素分子N端的Alal和C端的Lys30-Trp31-Lys32-Leu33共5个残基.用氧化还原型谷胱甘肽法完成二硫键配对,并用HPLC进行纯化,所得突变体与天然HWTX-的紫外光谱相似.质谱鉴定确认合成产物正确,分子量为3124,浓度为1×10-5g/ml的突变体能可逆阻断小白鼠膈神经-膈肌的接头传递,阻断时间为60～70min.与天然毒素比较,活性有所下降.结果说明HWTX-的N端、C端残基对其生物活性有一定影响,但不是位于活性中心的重要残基.由结果推测,虎纹捕鸟蛛毒素-的活性中心位于该分子中连接β-折叠的回环区     

化学合成虎纹捕鸟蛛毒素-I基因的克隆和表达

本文报道了全化学合成虎纹捕鸟蛛毒素－Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达,表达产物为Ｎ－端是谷胱甘肽硫转移酶的融合蛋白．经ＧＳＨ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化,凝血酶酶解融合蛋白,得到重组ＨＷＴＸ－Ⅰ（ｒＨＷＴＸ－Ⅰ）．质谱和氨基酸顺序分析均表明ｒＨＷＴＸ－Ⅰ系正确表达产物．还原复性的ｒＨＷＴＸ－Ⅰ表现出与天然ＨＷＴＸ－Ⅰ生物学活性的一致性．