慢病毒介导的RNA干涉对乳腺癌SKBR3细胞HER2受体的下调及生长抑制

大约30％的乳腺癌中有表皮生长因子受体家族蛋白HER2的过表达,此类癌症的预后差,恶性程度高。RNA干涉（RNAi）是最近发展起来能特异性抑制哺乳动物细胞中基因表达的新技术。本文在以往获得的能够产生良好基因沉默效应的小干涉RNA（siRNA）的基础上,构建了U6和H1双启动子siRNA表达载体,并转染HER2高表达乳腺癌SKBR3细胞定量测定了其HER2下调效应。随后,siRNA表达盒经LR重组反应被克隆入慢病毒载体中,在成功包装成病毒后,感染SKBR3并经荧光定量PCR、蛋白印迹杂交和流式细胞仪一系列实验证明慢病毒介导的RNAi确实能有效地下调肿瘤抗原HER2的表达。细胞长期增殖实验表明经慢病毒处理后细胞生长得到抑制。我们的研究为进一步阐明HER2与癌症恶化的关系以及发展新的基因治疗药物提供了工具和可能。     

肌球蛋白X干涉载体的构建与鉴定

肌球蛋白X(Myosin X,Myo X)是近年来发现的在细胞运动中发挥重要功能的非传统型肌球蛋白,但其发挥功能的分子机制目前尚不明确,RNA干扰技术是目前研究基因功能常用的方法。构建针对鼠的Myo X基因mRNA的shRNA真核表达载体,并转染NLT细胞,观察其对Myo X表达的抑制效应。结果显示,shRNA-2能够有效地降低Myo X的蛋白表达水平,而shRNA-1则不能。进一步分析显示,转染shRNA-2的NLT细胞丝状伪足的形成受到抑制,表明shRNA-2是能够抑制Myo X表达的干涉载体,此干涉载体的构建为进一步研究Myo X的新功能,揭示其作用的分子机制奠定基础。     

基于载体的RNA干涉介导人核受体hLRH-1的表达抑制实验研究

为探讨经RNA干涉法诱导人核受体hLRH-1的表达抑制的可行性,通过设计并构建能表达靶向人核受体hLRH-1基因的siRNAs的干涉载体pShLRH-1．1和pShLRH-1．2,经脂质体介导法转染人肝癌细胞BEL-7402,RT-PCR法鉴定hLRH-1基因的表达抑制效应,同时以同样方法分析焦磷酸法呢酯合成酶基因的表达情况。瞬时转染后分析结果表明,所构建的干涉载体pShLRH-1．1和pShLRH-1．2均能在细胞水平有效诱导hLRH-1基因的表达抑制,抑制率高达约80％;与未转染和空载体转染对照组相比,hLRH-1基因表达受抑的细胞中焦磷酸法呢酯合成酶基因的表达呈明显上调,提示hLRH-1可能在焦磷酸法呢酯合成酶基因的表达中起负调作用。     

一种快速筛选有效RNAi片段的方法

目的:介绍一种快速筛选有效RNAi片段的方法.方法:构建CC趋化因子配体2(chemokine(C-C motif)ligand 2,CCL2)的表达载体、干涉载体和检验载体;计算检验载体的绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞率;Real-time PCR检测干涉载体的干涉效果;计算PH 72h和168h转基因大鼠的肝再生率.结果:检验载体及其对照在24h表达GFP的细胞数最多,其中检验载体CCL2-CCL2(255)在各时间点的表达量均最低;Real-time PCR结果显示干涉载体CCL2(255)干涉效果较好;表达载体CCL2-N1能提高转基因大鼠PH 168h的肝再生率,达105%,而干涉载体CCL2(255)仅78%,与对照均有显著差异.结论:将靶基因和干涉片段构建到同一个载体上,通过观察、计算GFP的表达量可快速筛选有效RNAi片段,此法高效经济、省时省力.     

多聚亚基蛋白质在固-液界面团聚的测量与表征

以血红蛋白和乙肝表面抗原(HBsAg)为模型,联用双偏振光干涉分析仪(DPI)和原子力显微镜(AFM)研究在固-液界面上的吸附行为.结果发现:当溶液环境中血红蛋白的质量浓度为1.08 mg/mL时,测得在硅羟基表面吸附的平均厚度为3.54 nm,蛋白颗粒直径达60～ 150 nm,远高于血红蛋白的分子尺寸,说明血红蛋白在固-液界面上发生团聚.当HBsAg质量浓度为0.67 mg/mL时,测得在硅羟基表面及DEAE琼脂糖表面吸附的平均厚度分别为1.06和23.69 nm,表面吸附的蛋白颗粒直径分别为288～401和520 ～ 971 nm,是单分子HBsAg尺寸的13.1～44.1倍,表明在模型蛋白表面都形成了大的团聚体.     

基于谱域相干的细胞动态检测技术

将谱域光学相干层析技术（Spectral-domain Optical Coherence Tomography,SD-OCT）应用于细胞膜厚的动态检测,引入了光谱干涉测量方法,通过对干涉光谱信号进行离散傅里叶变换得到表示物体深度位置信息的光程差信号。搭建了一套SD-OCT测量系统并设计了专门用于细胞检测的样品平台,检测精度达到μm量级,信噪比达70 db,是一种快速、实时、非接触的细胞分子膜厚动态检测技术。     

TMV复制酶基因靶向的RNA干涉载体构建

以TMV复制酶基因作为RNAi的靶向序列,应用RT－PCR法获得目的DNA序列。依据RNAi机制,以酶切后连接的方法将目的DNA序列正向、反向锚定连接到pUCCRNAi载体质粒,构建含目的序列反向重复结构的RNA干涉中间载体;反向重复结构酶切后插入含超强启动子的pC2300-35s-OCS表达载体,重组的表达载体质粒经冻融法转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌中,完成双元载体系统的构建。每步的重组子经特异引物PCR验证和酶切验证有相应的特异条带存在,且测序鉴定序列正确。确认成功构建了TMV复制酶基因靶向的RNAi双元载体,为RNAi技术在植物病毒病害防治中的应用奠定基础。     

植物病毒载体的研究进展及其应用

综述了利用植物病毒载体过量表达或抑制基因表达方面的研究进展.这些技术的发展为工业制药和功能基因组学的研究提供了有力的研究工具.对病毒载体在应用中的局限性及其前景进行了分析.     

siRNA抑制丙型肝炎病毒IRES介导的基因表达

以HCVIRES为靶位 ,应用T7RNA多聚酶体外转录合成了 5条小干扰RNA(siRNA) .脂质体转染法将其导入HCVIRES介导萤光素酶表达的转基因细胞 (HepG2 .970 6 )中 ,通过测定萤光素酶的量 ,评价T7siRNA对HCV介导基因表达的抑制作用 .结果表明 ,所合成的 5条T7siRNAs ,均能特异性地抑制萤光素酶基因的表达 ,抑制率分别为 94 31%、80 0 1%、78 0 1%、80 33%、85 6 4% ,其中以靶向HCVIRES第二茎环结构的T7siRNA1抑制率最高 ,且对HCV基因的抑制作用有剂量依赖性 ,随T7siRNA1量的增加 ,抑制率逐渐增强 .siRNA抑制HCV基因的作用具有良好的特异性 ,改变其中 1个核苷酸即无显著抑制作用 .