一种标记cDNA芯片探针的新方法

探讨mRNA长片段反转录PCR技术(RT-LDPCR)在cDNA芯片微量探针标记和信号放大中的应用.首先提取BEP2D细胞的总RNA,然后用两种不同的方法进行标记,一种为RT-LDPCR,用荧光素Cy3-dCTP进行标记;另一种为传统的RNA反转录,用荧光素Cy5-dCTP进行标记.将两种方法标记好的探针等量混合后与含有440个点(44个基因)的cDNA芯片同时杂交,发现二者具有很高的一致性(0.5＜Cy3/Cy5＞2.0).由于RNA反转录法为cDNA芯片探针标记的传统方法,从而验证了RT-LDPCR用于cDNA芯片探针标记的可行性.RT-LDPCR具有对样品总RNA的需要量少和可对样品中信号进行放大的优点,特别适合于对材料来源受到限制的RNA进行标记.     

以抑制消减杂交法筛选肿瘤耐药相关基因

避开化疗诱导多药耐药性的常规方法,建立烷基磷脂类化合物（十六烷基磷酸胆碱,HePC)诱导人上皮性肿瘤细胞系产生交叉耐药。旨在以新的角度认识肿瘤多药耐药性,揭示新的调控机制。利用抑制消减杂交技术,对库进行克隆分析,在获得的可分析的78个克隆中,27%没有同源基因片段或同源性很低,暂定为“新基因”;14%具有染色体明确定位,认为是化疗敏感肿瘤KB细胞所特有的cDNA片段;19%在人类EST库库MGC和CGAP中出现,可能是肿瘤细胞特有基因;发现与耐药相关的巳知功能基因高达40%。     

DNA甲基化与肿瘤

DNA甲基化参与基因的表达调控。DNA甲基化异常与肿瘤等疾病有关,抑癌基因启动子区的异常甲基化和癌基因的去甲基化均影响肿瘤的发生发展过程,肿瘤细胞的总体甲基化水平比正常细胞低,但是伴有某些CpG岛甲基化程度增高。     

cDNA芯片的重复性研究

cDNA芯片正在成为基因表达研究的常用方法,用此法通过一次杂交即可获得大量基因的表达信息[1,2]。目前,一些专业的生物芯片公司已推出部分cDNA芯片产品供研究者应用,然而,由于价格昂贵及受到其他一些条件的限制,国内众多研究者很难对芯片结果进行多次杂交验证,因此cDNA芯片的重复性就成为他们关心的问题,本实验对cDNA芯片用于基因表达研究的重复性进行了研究。１材料与方法１．１探针和cDNA芯片的制作按文献[3]中的方法合成R15Hp35T细胞的探针10μl,以荧光素Cy5-dCTP进行标记。同时制作含有61个基因的cDNA芯片,共10片。…     

肺癌相关基因芯片的制作

探讨肺癌相关基因芯片的制作过程及其在基因表达谱方面的应用,同时对一些传统的技术环节进行了改进。首先有目的搜集了60个肺癌相关基因,用修饰后的引物将其分别克隆,经纯化、变性后,用Cartesian PinSys5500 cDNA Microarray点样仪以微阵列的形式将其点布于醛基化的玻璃片上;然后将人支气管上皮恶性转化细胞模型BEP2D细胞的原代、20代、35代的总RNA逆转录后再经LD PCR标记成荧光探讨与基因芯片进行杂交。ScanArray 3000荧光扫描仪扫描后显示,图象背景均匀、信号清晰,证实该芯片制作成功,并能取得良好的杂交效果。     

总RNA和mRNA来源的探针与cDNA芯片杂交的差异研究

提取BEP2D细胞的总RNA并按两种方式进行cDNA芯片探针的标记,一种是将100μg BEP2D细胞的总RNA利用逆转录法直接标记成荧光探针,另一种是先从100μg BEP2D细胞的总RNA中分离出mRNA,然后再标记成荧光探针。将两份标记好的探针同时与含有230个基因的cDNA芯片杂交。杂交后的芯片经Axon4100B扫描仪扫描,发现两种方式标记探针的一致性为93．04％,并且mRNA来源探针杂交后的荧光信号值较总RNA的弱。探讨了这两种方法标记探针在基因芯片表达谱研究中的差异性,目的是为利用这两种方法标记探针进行基因表达谱研究提供一些依据。     

真核生物的DNA甲基转移酶与DNA甲基化

真核生物的ＤＮＡ甲基化就是在ＤＮＡ的ＣｐＧ二核苷酸胞嘧啶的第 5位碳原子上加上甲基 ,催化这一过程的是ＤＮＡ甲基转移酶 (Ｄｎｍｔ)。ＤＮＡ的甲基化修饰参与基因表达调控、胚胎发育、细胞分化、基因组印迹、Ｘ染色体灭活和细胞记忆等诸多重要生物学过程[1,2 ] 。在不同组织或同一类型细胞的不同发育阶段 ,基因组ＤＮＡ上各ＣｐＧ位点甲基化状态的差异即构成基因组的ＤＮＡ甲基化谱。根据催化反应类型。可以将ＤＮＡ甲基转移酶分为三类 :第一类将腺嘌呤转化成Ｎ6 甲基腺嘌呤 ;第二类将胞嘧啶转化成Ｎ4 甲基胞嘧啶 ;第三类将胞嘧啶转化成…     

抑制消减杂交和辐射小鼠血虚模型筛选"四物汤"诱导表达的基因

应用抑制性消减杂交技术构建受辐射小鼠血虚模型在中药四物汤诱导前后消减cDNA库,并从中克隆鉴定出与四物汤药效相关基因。从受辐射小鼠四物汤诱导前后骨髓细胞中提取mRNA并合成cDNA,分别作为tester和driver进行消减杂交及抑制性PCR,将PCR产物与载体连接构建cDNA库,高效电转化大肠杆菌进行库扩增,随机挑取其中的克隆进行酶切、测序分析。成功构建了具有高消减效率的受辐射小鼠四物汤诱导前后的消减cDNA库。库挑选得到512个阳性克隆。随机挑取30个插入片段测序,生物信息学分析结果显示大部分与红细胞分化、骨髓组织修复、结构重建有密切关系,其中8个为新基因片段。应用抑制性消减杂交技术所构建的受辐射小鼠四物汤诱导前后cDNA消减库为大批量筛选、克隆四物汤药效特异性相关基因奠定了基础。并从分子水平上发现四物汤对抑制凋亡、促进骨髓组织修复和结构重建、诱导红细胞分化的基因具有调节作用,可能和四物汤补血作用有关。     

蛋白质芯片-飞行质谱技术

蛋白质芯片-飞行质谱技术(Proteinchip—Surface Enhanced Laser Desorption／Ionization,SELDI)是21世纪出现的一种新型生物芯片技术,是研究表达蛋白的有力工具。本对该技术的原理、构成、使用方法、应用等做了简要介绍。