禽脑脊髓炎病毒VP0基因的克隆与序列测定

禽脑脊髓炎（avian encephalomyelitis,AE）又名流行性震颤,是一种主要侵害1月龄内雏鸡的病毒性传染病。该病传染迅速,既可垂直传播又可水平传播,危害极大。世界许多国家和地区均有该病发生和流行的报道。我国学者张泽纪等于1980年首次发现广东有疑似此病,1982年李心平等通过病理学方法确认此病,随后在我国各地均发现该病的发生和流行,给养鸡业造成较大的损失。 　　禽脑脊髓炎病毒（AEV）是一种无囊膜的二十面体对称的病毒粒子,大小为26nm左右。Shafren和Tannock（1991）利用放射性碘标记电泳分析AEV的结构蛋白发现,它主要有3种结构蛋白即VP1、VP2和VP3。Marvil等（1999）测定了AEV疫苗株1?143株的全基因组序列,揭示出AEV结构蛋白有VP1、VP2、VP3和VP4,其中VP2和VP4又合称VP0。我们从河北地区某艾维因肉鸡群自然发病的肉雏鸡脑组织中分离鉴定出一株AE病毒-L2Z株。根据发表的AEV序列设计引物,利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术,在体外从AEV分离株感染的SPF鸡胚病变组织中扩增出VP0基因,在该片段的5′和3′端均加上KpnI位点,成功地将VP0 cDNA插入到质粒pBssK的KpnI位点之间,获得阳性克隆,并对其进行测序。结果发现,该基因长726bp,编码242个氨基酸,与AEV 1?143株VP0基因的核苷酸与氨基酸之间的同源性分别为95.2%和97.5%,而与小RNA病毒科其它病毒属如人甲肝病毒HAS-15株相应基因核苷酸和氨基酸之间的同源性分别为50.1%和50.8%,与肠道病毒属的PV-1 Sabin株的同源性分别为20.5%和16.5%,与鼻病毒属的HRV-14株的同源性分别为25.5%和17.8%,与心病毒属的EMCV PV2株的同源性分别为25.9%和19.4%,与口蹄疫病毒属FMDV-C株的同源性分别为26.3%和18.6%,与人类肠道致细胞病变孤儿病毒ECHOV的同源性分别为24.9%和16.1%。在系统发育树上,L2Z株与AEV 1?143株之间的距离最近,其次与甲肝病毒之间距离较近,而与小RNA病毒科其它病毒属之间的距离较远。 　　Marvil等（1999）首先测定出AEV 1143株的全基因序列,发现与甲肝病毒HM-175株之间氨基酸同源性为39%,与该科病毒其它病毒属之间的氨基酸同源性为19%～21%,其中VP0基因与甲肝病毒HM-175株相应基因氨基酸之间同源性达到71.8%,认为AEV与甲肝病毒属之间关系密切。Todd等（1999）对AEV VR株的3′端869bp序列测定表明,它与甲肝病毒相应区域氨基酸之间的同源性为35.7%,均高于与该科病毒其它病毒属相应氨基酸之间的同源性,也认为AEV与甲肝病毒之间最为接近。本试验发现：AEV分离株L2Z株VP0基因与甲肝病毒相应氨基酸之间的同源性为50.8%,而与该科病毒的其它属病毒相应氨基酸之间同源性仅在16.1%～21.9%之间。从系统发育树上也进一步表明,AEV L2Z株与甲肝病毒之间同源性之间距离最短,亲缘关系最近,而与肠道病毒属之间亲缘关系较远。第6次国际病毒学分类报告中将AEV划为小RNA病毒科肠道病毒属,但从我们的实验结果与Marvil等（1999）和Todd等（1999）的报道,从基因水平上证明AEV与甲肝病毒属更接近,而与肠道病毒属亲缘关系较远,因此认为AEV是否归为小RNA病毒科肠道毒属有待进一步确定。 　　本研究成功地进行了AEV分离株VP0基因的克隆与序列测定,为下一步进行AEV基因结构研究打下了基础。     

乳酸菌的分离、鉴定及其生长特性

从动物粪便中分离乳酸菌,得到产酸快、代谢物抑菌活性强的乳酸菌菌株共６株。其中Ｏ－２菌株的产酸、抑菌、耐酸、耐胆盐和生长性能都优于其他菌株,是一株有潜质的有益菌菌性,经鉴定表明为乳杆菌。不同的营养配比的液体培养基进行发酵实验表明,Ｒ２培养基配料简单,成本低,发酵２４ｈ产生的菌体总数多,４８ｈ培养液的抑菌活性强,且其抑菌活性具有一定的热稳定性。     

噬菌体肽库技术的应用

噬菌体肽库是由大量带有不同肽段的单个噬菌体组成的重组噬菌体库,通过分析筛选到的多肽的结构和序列,可以了解蛋白质分子之间的相互作用。随着生物技术的发展,噬菌体肽库技术在基因治疗、抗原表位定位、确定核酸结合蛋白、基因疫苗研究和药物筛选等方面得到广泛应用并取得了很大进展。     

乳酸杆菌体外对大肠埃希菌O-78拮抗作用试验

目的：研究乳酸杆菌体外对大肠埃希菌O-78的拮抗作用。方法：将乳酸杆菌与大肠埃希菌O-78体外共培养观察拮抗情况及用电镜观察形态变化。结果：等量同时间接种,24h内乳杆菌就将大肠埃氏菌O-78全部抑杀;乳酸杆菌早24h接种,4-8h内将大肠埃希菌O-78全部抑杀;大肠埃希菌O-78早24h接种,在12-24h内全部被抑杀。电镜观察发现,经乳酸杆菌培养液处理,大肠埃希菌O-78细胞膜形态发生变化。结论：本试验中所用乳酸杆菌体外具有抑制杀死大肠埃希菌O-78的作用。     

用基因疫苗制备H9亚型禽流感病毒单克隆抗体

用H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因反转录cDNA第一链PCR扩增其HA基因,PCR产物与pcDNA3.1( )质粒构建重组质粒作为基因疫苗免疫8周龄Balb/C小鼠,细胞融合后用血凝抑制试验(HI)和ELISA试验检测细胞培养上清,各获得一株阳性细胞株,经3次亚克隆后都能稳定分泌H9AIV特异性抗体。特异性检测与NDV、H5亚型AIV、产蛋下降综合症(EDS76)病毒毒株没有反应,2株单抗经亚型鉴定均为IgG2b,轻链的亚型为kappa链。所获得的单克隆抗体将在禽流感快速诊断和疾病预警监控中发挥重要作用。     

封闭带毒素

封闭带毒素（ZOT）是霍乱弧菌编码的第二个毒素,相对分子质量约45000,zot基因位于鞭毛噬菌体CTXΦ基因组中,ZOT通过激活复杂的细胞间一系列级联反应来调节紧密排列的上皮细胞结构,可逆地调节上皮细胞的通透性,从而影响大分子物质的吸收,ZOT及其人类组织类似物zonulin受体广泛存在于多种组织以及传代细胞中,ZOT与其上皮细胞受体的结合位点位于ZOT的118～299氨基酸之间,由于其独特的生物学性质,使用ZOT有可能开辟一种新颖的生物大分子药物口服给药新途径,给制药工业及疫苗工业展示了光明的前景。     

肌肉生成抑制因子基因的克隆、表达及动物免疫实验

采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术, 从猪骨骼肌中扩增得到肌肉生成抑制因子基因(myostatin, MSTN), 将其克隆到pGEM-T载体中, 进行序列测定. 结果表明, 克隆得到的MSTN基因序列是由1128个核苷酸组成. 将此基因序列提交至基因库中, 获得的注册号为AY48008. 将该基因编码信号肽序列的75个碱基去掉再进行表达, 结果表明该基因在大肠杆菌中成功表达. 对所表达的融合蛋白进行提纯后制备油佐剂疫苗免疫昆明小白鼠, 结果是实验组的小白鼠的体重高于对照组, 但差异不显著. 实验组的小白鼠的子代体重也高于对照组的小白鼠的子代体重, 尤其是在第3天, 体重达到2.63 g, 比对照组高10.5%, 差异达显著水平(P < 0.05).     

禽流感病毒核蛋白在噬菌体表面的展示

利用PCR技术,扩增禽流感病毒（AIV）核蛋白基因片段,将其克隆至pR质粒的T4噬菌体SOC基因C末端获得重组质粒pR—np,以此重组载体转化大肠杆菌Escherichia coli2（E2）,用溶菌酶缺陷噬菌体T4-zl感染重组E2菌,重组载体与缺陷噬菌体T4-zl基因发生同源重组,将np基因整合到噬菌体基因组中,用PCR方法筛选重组噬菌体并命名为T4-zl—np。经Western blot免疫电镜与ELISA检测证实,T4-zl-np表达的NP融合蛋白具有免疫学活性。结果表明,AIV核蛋白成功地在T4噬菌体表面展示,为禽流感防治奠定了基础。     

H5亚型AIV NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

应用DNAStar软件,参照Genbank中注册的AIV H5亚型毒株NS1基因序列,设计了一对引物,用RTPCR方法成功地扩增出带双酶切位点的H5亚型AIV的NS1基因,通过BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切位点将H5NS1基因插入转移质粒裁体pFastbac HTa中,获得重组转移载体pFastbac HTa-H5NS1并将其转化DH10 Bac细胞,与Bacmid发生位点特异性转座作用,得到重组穿梭载体Bacmid-H5NS1,再将其转染昆虫细胞High Five,PCR鉴定证实该基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游,经过SDS-PAGE和Western Blot检测,NS1基因在High Five细胞中得到了表达,H5NS1大小约为28kD,而且表达的产物具有特异免疫学反应性.     

烟酸铬对奥尼罗非鱼生长及组织营养成分的影响

鱼类对糖的利用能力低于畜禽,饲料中最适的糖水平如黄尾(鱼狮)小于10%,太平洋鲑鱼小于20%,沟鲶为25%-30%,罗非鱼为40%1.在糖耐量实验中,鱼类表现持续的高血糖反应2,类似糖尿病型患者的反应。在哺乳类和人类的研究结果证实,微量元素铬(Cr)能恢复大鼠和儿童受损的葡萄糖耐量2,增强胰岛素的作用,铬参与组成葡萄糖耐量因子,提高大鼠和小鼠的生长和存活3.饲料中添加三氯化铬等化合物,显着提高罗非鱼对葡萄糖饲料的摄食量、增重率、蛋白质积累、能量积累和肝糖原含量4,提高鲤对葡萄糖的利用5.有机铬对鱼类的生长和饲料利用有何影响, 其作用机制如何, 是否和哺乳类相同, 这方面研究未见报道。本试验观察了烟酸铬对罗非鱼生长、饲料利用和组织营养成分的影响,旨在为进一步探讨铬对鱼类糖利用的影响及其作用机制奠定基础.