牛SRY蛋白表达纯化与体外功能鉴定

利用PCR技术从北京黑白花奶牛(Bostaurus)的基因组DNA中克隆了SRY(Sex-determiningregionontheYchromosome)基因编码区全长序列。序列分析表明牛SRY基因的HMG区(Highmobilitygroup)呈现高度的保守性,与人、小鼠、猪等的相似性达到70%。将SRY基因与pET-28a( )载体相连,构建表达载体pET-28a/SRY;把该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导30℃诱导4h,SRY蛋白可高效表达,表达产物占总蛋白量的26%。对表达产物进行了Western-blotting检测,并采用亲和层析技术获得了高纯度的牛SRY蛋白。通过PCR技术分别获得牛、人、鼠的苗勒氏管抑制物(MullerianInhibitingsubstances,MIS)启动子,凝胶阻滞试验证明,牛SRY蛋白可与人及牛的MIS启动子结合,但与鼠的Mis启动子不发生相互作用。     

受精环境对哺乳动物性别形成的影响

性别控制是人类很早就关心的研究领域, 许多重要的经济性状与性别有直接的关系。控制受精环境即可控制性别, 这种方法不需昂贵的仪器设备或者药品, 易实践, 可普遍应用, 其经济效益和社会效益难以估量。文章综述了受精环境对哺乳动物性别形成影响的研究进展。这些环境因素包括母体生殖道中精氨酸含量、胚胎发育过程中子宫内葡萄糖浓度、输精时卵母细胞成熟程度以及哺乳动物受孕时生殖激素的水平等方面, 为进一步开展性别控制研究积累一定的资料。     

牛性别决定新基因Fgf9的克隆及生物信息学分析

Fgf9基因是脊椎动物性别决定中重要的信号因子,它在睾丸发育过程中参与Sertoli细胞的增殖和睾丸索的形成。基于表达序列标签（expressed sequence tags, ESTs）克隆原理,采用序列拼接和 RTPCR方法获得了荷斯坦奶牛Fgf9基因的cDNA序列,并对其组织表达特征进行分析。利用生物信息学方法对Fgf9基因序列和蛋白结构进行分析。结果显示：Fgf9基因定位于牛12号染色体上,cDNA全长为697bp,开放阅读框为627bp,编码208个氨基酸,分子量23.38245kDa,等电点7.0600。RTPCR证实该开放阅读框正确,在牛的各组织中均有表达,且与牛其他cDNA无同源性,获得GenBank登陆号为：EU693028。功能结构分析显示Fgf9蛋白具有典型的FGF家族保守结构域,包括受体相互作用位点和肝素结合位点。信号肽预测显示牛Fgf9蛋白可能不存在信号肽序列。
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RNP免疫沉淀技术在斑马鱼胸苷酸合成酶基因翻译调控研究中的应用

为检测斑马鱼胸苷酸合成酶基因的表达产物TS蛋白在体内是否结合于自身的mRNA,并进一步检测TS蛋白与c-myc mRNA的结合情况。采用免疫沉淀结合得到相应的RNA,即RNP免疫沉淀技术,进一步结合RT-PCR技术分析与蛋白结合的核酸序列,并用Western蛋白印迹分析了TS蛋白。结果显示,人的TS106单克隆抗体可以免疫沉淀斑马鱼的TS蛋白,抗体免疫沉淀的核酸中含有TS mRNA和c-myc mRNA。在斑马鱼中,TS蛋白在体内结合于自身的TS mRNA,并能结合c-myc mRNA,参与基因的表达调控,阐明了TS的翻译调控机制在体内条件下的作用方式,同时也为构建斑马鱼抗肿瘤药理模型提供了理论基础。     

微生物嗜盐酶盐适应性的分子结构基础研究

由高盐环境中生长的微生物里分离出的嗜盐酶在高盐度下仍然具有催化活性,工业上具有良好的应用前景。一些嗜盐酶已被克隆纯化出来,它们的分子结构特点也已经被广泛研究。该文从嗜盐酶的蛋白质序列和结构特征等方面综述了嗜盐酶嗜盐的分子结构基础研究进展,分析了存在的问题并对未来工作提出了展望。研究嗜盐酶盐适应性的分子基础,可以为新的功能蛋白的发展和鉴定提供依据。     

一株中度嗜盐细菌whb45的鉴定及其抗菌与抗肿瘤活性筛选

从盐场中分离鉴定中度嗜盐细菌并对其潜在的抗菌和抗肿瘤活性进行评价。从山东威海的鹿道口盐场分离嗜盐细菌,对菌株whb45进行形态学和生理生化特性研究,测定其16SrRNA序列并通过同源性比对进行系统发育分析,采用抗菌和细胞毒模型进行活性筛选。试验结果表明,菌株whb45为中度嗜盐细菌,whb45与Halobacillus trueperi在形态和生理生化特征方面最接近,16SrRNA序列相似性为99%。whb45的粗提物对多种细菌、真菌和肿瘤细胞的生长都具有较强的抑制作用,可以作为发现生物活性物质的潜在的新来源。     

siRNA介导Sry基因沉默对小鼠胚胎性别决定基因表达的影响

为研究Sry基因的调控网络, 采用siRNA表达载体介导的RNAi技术, 特异性地抑制睾丸决定因子Sry在小鼠胚胎中的表达, 并观察Sry基因沉默后对在两性性腺分化中起重要作用的Wt1, Sf1, Dax1, Gata4, Sox9及Amh基因表达的影响。利用本课题组先前构建的siRNA重组表达载体(pSilencer4.1/Sry217及pSilencer4.1/Sry565), 通过尾静脉注射法导入妊娠9.5天(9.5 dpc)的母鼠体内, 在11.5 dpc时取胚胎, 对性别鉴定为雄性的胚胎以RT-PCR法和Western-blot检测Sry基因的表达抑制效果, 并同时用定量PCR法检测Wt1等上述性别决定相关基因表达变化情况。结果表明, 注射干扰质粒后48 h Sry基因的mRNA和蛋白表达水平均降低, 其中siRNA表达质粒pSilencer 4.1/Sry 565的抑制效果显著, 可达到80%的抑制率。Sry基因沉默后, Wt1基因表达量显著升高; Sf1, Dax1, Gata4, Sox9基因表达水平没有明显变化; Amh基因无表达。试验结果表明, Sry基因表达抑制会导致Wt1基因表达升高; 另外, Sry基因激活Sox9基因的表达可能需要其他的辅助因子协同作用。     

小鼠胚胎Sry基因的RNA干涉研究

为了研究 Sry 基因的调控网络,采用 siRNA 技术使 Sry 基因沉默,探讨了有效沉默 Sry 基因的途径和最佳条件. 设计、合成针对小鼠 Sry 基因的发夹状寡核苷酸链,退火后连入真核表达载体pSilencer 4.1-CMV neo vector,构建以小鼠 Sry 基因为靶点的 siRNA 干涉载体 pSilencer 4.1/Sry217及 pSilencer 4.1/Sry565,通过尾静脉注射法将载体质粒导入妊娠小鼠体内,于小鼠妊娠第 11.5 天,即 11.5 dpc (days post coitum,性交后天数) 取出胚胎,采用双重 PCR 法对胚胎进行性别鉴定,鉴定为雄性的胚胎采用半定量 RT-PCR 法检测Sry 基因的表达量,研究不同干扰序列、不同注射时间及注射剂量对 Sry 基因表达量的影响. 研究结果,确定了质粒的最佳注射时间为 9.5 dpc,注射剂量为 20 μg,注射干扰质粒 pSilencer 4.1/Sry565 对 Sry基因的抑制效率达 85% 左右. 结果表明,siRNA 可以显著抑制雄性胚胎 Sry 基因的表达.     

小鼠胚胎Sry基因的RNA干涉研究

为了研究Sry基因的调控网络,采用siRNA技术使Sry基因沉默,探讨了有效沉默Sry基因的途径和最佳条件.设计、合成针对小鼠Sry基因的发夹状寡核苷酸链,退火后连入真核表达载体pSilencer4.1-CMVneovector,构建以小鼠Sry基因为靶点的siRNA干涉载体pSilencer4.1/Sry217及pSilencer4.1/Sry565,通过尾静脉注射法将载体质粒导入妊娠小鼠体内,于小鼠妊娠第11.5天,即11.5dpc(dayspostcoitum,性交后天数)取出胚胎,采用双重PCR法对胚胎进行性别鉴定,鉴定为雄性的胚胎采用半定量RT-PCR法检测Sry基因的表达量,研究不同干扰序列、不同注射时间及注射剂量对Sry基因表达量的影响.研究结果,确定了质粒的最佳注射时间为9.5dpc,注射剂量为20μg,注射干扰质粒pSilencer4.1/Sry565对Sry基因的抑制效率达85%左右.结果表明,siRNA可以显著抑制雄性胚胎Sry基因的表达.     

运用 mRNA 体外展示技术筛选胸苷酸合成酶 RNA 亲和肽

以体外选择方法筛选不同功能的核酸、肽和蛋白质是近年的研究热点, mRNA 体外展示是一种新兴的高效多肽选择技术,其基本原理是通过含嘌呤霉素寡核苷酸的 Linker 使 mRNA 与它编码的肽或蛋白质共价结合,形成 mRNA- 蛋白质融合体,这一方法已用于多种功能肽的鉴定 . 以 mRNA 体外展示技术进行了由大容量多肽库中 (>1013) 筛选胸苷酸合成酶 (thymidylate synthase , TS) RNA 亲和肽的研究,通过精密的实验设计,建立了一套完整有效的筛选方法,并对实验条件进行了优化 . 已进行了 8 轮筛选,结果表明,以 mRNA 体外展示技术获得的多肽分子,可以与 TS mRNA 亲和 . 将测序结果与初始肽库进行比较,发现亲和肽中碱性氨基酸及芳香族氨基酸含量明显增加,说明其在与 RNA 结合中具有重要作用 . mRNA 展示技术作为一种大容量文库的体外筛选方法,将广泛应用于与固定化靶物质具高度亲和性及特异性的多肽和蛋白质的筛选 .