液滴微流控芯片系统中微液滴特性表征及氨基酸检测应用

基于液滴微流控芯片的检测和筛选系统,因其具有通量高、成本低等显著特点,近年来备受关注。该系统生成的微液滴(皮升体积)具有直径均一、大小可控、互不交融(单分散性)等特性,它作为微反应器可以进行微生物及其代谢物包埋实验和高通量检测。因此,研究微液滴的相关特性及其应用具有重要意义。文中在液滴微流控芯片系统搭建的基础上,对重要氨基酸(谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)分别进行了微液滴包埋实验,研究了包埋微液滴的重要特性参数(如稳定性、扩散性等),探索了包埋微液滴对氨基酸检测分选的应用。实验表明,文中搭建的液滴微流控芯片系统可以稳定、均一地生成微液滴,微液滴大小可根据需要控制在2 0-5 0μm之间,微液滴间无交叉污染,包埋氨基酸的微液滴的检测筛选速度大约为每分钟6 0 0个。这个研究为高通量分析和筛选产氨基酸的微生物奠定了基础。     

抗菌活性放线菌的界面微滴移液互作分离筛选方法

【背景】放线菌是天然产物的宝库,目前应用于临床的天然抗生素有70%来源于放线菌的次级代谢产物。随着细菌对传统抗生素耐药问题的日趋严重,如何从自然生境中高效筛选新型活性放线菌资源并发现新型抗生素成为当前微生物学者面临的重要挑战。通过传统方法筛选活性放线菌不仅费时费力、试剂耗材消耗量大,并且筛选通量非常有限,难以对自然样品中的复杂微生物群落进行整体全面的解析。【目的】提出一种基于多孔板液滴阵列培养的新策略,可高通量筛选抗菌活性放线菌。分析模式放线菌在微液滴中的培养特征与筛选条件,为进一步建立基于液滴阵列技术的超高通量活性放线菌筛选平台奠定基础。【方法】采用界面移液技术,将传统的多孔板高通量筛选体系微缩至1μL水平,在油相填充的多孔板(96孔板)中生成微升培养液滴阵列,每个微孔液滴中封装一个放线菌孢子或菌丝团。经过短期培养,放线菌在微滴中完成菌丝分化与次级代谢产物的分泌。这时,通过第二步界面移液技术与液滴融合加入带有荧光标记的指示菌,通过全菌拮抗筛选定位活性目标菌株,并将活性谱转化为量化的荧光数值。【结果】通过对模式放线菌的测试发现,放线菌菌丝可以在微液滴中达到最佳培养状态,并积累足够的生物质与代谢物,对荧光指示菌有明显的抑制作用。【结论】通过建立上述基于微孔板液滴阵列的高通量筛选技术,能从单细胞水平快速筛选出具有抑菌活性的菌株,显著节约了筛选成本并提高了筛选通量,为新型活性天然产物的发现提供了一种新的简单有效的筛选方法。     

微生物组测序与分析专家共识

在过去的十几年,微生物组相关研究和应用持续升温。微生物组逐渐成为生命科学、环境科学和医学等领域的研究焦点。与此同时,全球多个国家和组织也都积极发起各自的微生物组计划,进行多方面的布局,力争在这一具有广阔前景的领域获得战略地位。此外,无论是科研还是产业应用已经迎来了研究高潮和投融资热潮,微生物组相关产品和服务也不断出现。然而,行业在快速发展的同时,也存在一些不足。由于微生物组测序和分析相关技术和方法发展迅速,各国研究和应用尚未在技术、方案和数据等标准上达成统一,国内行业参与者对微生物组也存在认识不足,对微生物组相关新方法、新技术、新理论等还未能充分掌握和使用。除此之外,已有的一些标准和指南,内容过于简单,实操性也不足,这不仅给科研数据的整合造成了困难和资源浪费,还给相关企业进行不良竞争、以次充好提供了机会。更重要的是,我国尚缺乏微生物组相关的国家标准,国家微生物组计划仍处于筹备过程。在此背景下,中国生物工程学会、中国科学院微生物研究所于2019年6月至2020年3月,共同设立了“微生物组测序与分析专家共识”专项研究课题。中国生物工程学会组织了微生物组相关领域的27位专家以及来自行业内的30多位专业人员,通过分成4个项目小组、召开4轮研讨会后,最终形成了涵盖从微生物采集与保存、DNA提取与建库、高通量基因测序和数据分析以及质控标准品等全流程的“微生物组测序与分析专家共识”。本专家共识具有较强可参考性和可操作性,不仅能指导国内科研和产业机构规范进行微生物组相关产、学、研,还能为国家相关职能部门提供可参考的技术依据,保障规模型和规范化的企业利益,加强行业自律,避免不规范的企业扰乱市场,最终促进微生物组相关产业的良性发展。     

单细胞、显微计数和高通量测序典型水稻土微生物组的技术比较

【目的】比较传统显微计数、单细胞分选和现代分子方法研究典型水稻土微生物组的细胞数量、物种组成及好氧甲烷氧化菌生理生态过程的技术特点。【方法】针对水稻土中可提取微生物细胞(土壤细胞)及其DNA(细胞DNA)、单细胞DNA、土壤微生物组总DNA(土壤DNA),利用传统显微计数和实时荧光定量PCR(qPCR)方法,研究水稻土好氧甲烷氧化过程中微生物数量的变化规律;通过高通量测序16S rRNA基因技术,研究微生物物种组成的变化规律。【结果】水稻土微生物组的传统显微计数结果显著低于现代分子方法 qPCR,最高可达3个数量级。基于DAPI染色、CARD-FISH、细胞DNA及土壤DNA的qPCR定量结果分别为:(5.8–7.4)×10~7、(1.7–1.9)×10~7、(2.8–6.3)×10~8、(1.5–2.7)×10~(10) cells/g。基于qPCR的水稻土好氧甲烷氧化菌数量为1.1×10~7 cells/g,比传统显微计数方法高3个数量级。然而,当水稻土氧化高浓度甲烷后,所有方法均发现甲烷氧化菌显著增加,增幅分别为54倍(CARD-FISH)、388倍(细胞DNA)和45倍(土壤DNA)。在微生物分类学门的水平,细胞DNA(25个门)与土壤DNA(30个门)结果基本一致,均能较好地反映水稻土微生物组的群落结构,而单细胞DNA尽管检测到20个门,但偏好性较大,95%以上均为Proteobacteria。在微生物分类学属的水平,土壤DNA、细胞DNA和单细胞DNA分析均表明背景土壤含有7个好氧甲烷氧化菌的pmo A基因型,但氧化高浓度甲烷后,γ-Proteobacteria的2个属Methylobacter/Methylosarcina则成为优势类群。【结论】土壤微生物的传统显微计数(DAPI和CARD-FISH)结果显著低于qPCR技术,相差1–3个数量级。qPCR定量土壤DNA和细胞DNA表明:水稻土可提取微生物细胞约占土壤微生物总量的2%左右,而好氧甲烷氧化菌的提取效率最高可达6%。细胞DNA在门水平能较好地反映水稻土微生物组成,但在属水平和土壤DNA有着较大差异。Planctomycetes微生物门的细胞易被提取,Acidobacteria门的微生物则较难被提取,而单细胞分选技术则偏好Proteobacteria。尽管传统方法和分子技术的分辨率明显不同,但均能较好地表征水稻土甲烷氧化的微生物生理生态过程。未来土壤微生物组研究应更加重视科学问题本身对技术手段的内在需求,最大限度发挥各种先进技术的优势。     

基于微流控的生物被膜研究进展及口腔微生态系统应用展望

口腔是人体最重要的微生物储藏库之一,这些微生物通常以生物被膜的形式稳定地黏附于口腔内粘膜及牙齿表面,在病理条件下则可以深入髓腔及牙槽骨内,成为龋病、根尖周炎、牙周病等常见口腔疾病的主要病因,甚至与许多全身性疾病密切相关。在人类口腔微生态系统中,微生物种类繁多,生物被膜的构成及相互作用关系复杂,目前对其认识还十分有限;此外,在宿主免疫、口腔内外多种理化因素的调控下,生物被膜还可以出现不同的表型及生物特性,因此对其致病机制的研究也具有挑战性。微流控技术作为一种能够灵活操控微尺度流体的技术,不仅能够精准模拟理化微环境,还能够进行高通量可视化的分析,在生命分析化学及生物被膜的研究方面已经展现出显著优势,在口腔微生态系统研究中具有广阔的应用前景。本文将回顾近期微流控技术在生物被膜方面的研究进展,并结合口腔微生态系统中生物被膜研究的关键问题对微流控技术的应用做系统阐述和展望。     

基于流式细胞仪高通量分选的深海微生物单细胞培养

【目的】建立适用于海洋微生物的流式细胞分选与高通量单细胞培养的方法,通过该方法从印度洋深海样品中分离微生物纯培养菌株。【方法】利用流式细胞仪单细胞分选功能,以前向角(FSC)和侧向角(SSC)散射光信号代替荧光信号作为分选逻辑,对深海水体和沉积物样品中微生物进行单细胞高通量分选和培养。【结果】确定了流式细胞分选的区域和条件,发现所建立方法适于分离海洋水体微生物,而不是沉积物微生物。从印度洋深海水体样品中获得61个潜在新菌株,分属于6个新属种,占分离菌株总数的26.29%,其16S rRNA基因序列与已培养的模式菌株相似性为89.79%–95.37%。【结论】本研究所建立的方法有助于提高发现海洋微生物新物种的效率,获得更多新的海洋微生物资源。