南极深海沉积物宏基因组DNA中低温脂肪酶基因的克隆、表达及性质分析

从南极普利兹湾深海900米深的沉积物中提取获得宏基因组DNA,并通过设计引物,从中克隆到全长为948bp的低温脂肪酶(lip3)开放阅读框完整序列,该基因编码一个由315个氨基酸残基组成、预计分子质量为34.557ku酶蛋白(Lip3);氨基酸序列上的GFGNS(GXGXS)和G-N-S-M-G(GXSXG)在许多脂肪酶中有很高的保守性,它们是水解机制所必需的序列,也是丝氨酸水解酶中最保守的序列.构建了lip3基因重组表达载体,并在大肠杆菌中获得表达,采用镍离子亲和层析柱对表达的酶蛋白Lip3进行纯化,得到约35ku蛋白条带,酶学性质的分析表明,该酶的最适作用温度为25℃,在0℃时表现为最高活力的22%,最适pH值为8.0,对热敏感,35℃热处理60min剩余酶活为10%,以硝基苯棕榈酸酯为底物,Lip3的酶促反应常数Km值随着反应温度的升高而升高,是典型的低温酶.     

棕色固氮菌细菌铁蛋白释放铁的动力学方程和性质

棕色固氮菌细菌铁蛋白铁核中的磷铁组成存在非均匀性。细菌铁蛋白释放铁的动力学特性表现出复杂性。通过动力学曲线分析,提出蛋白壳自身调节能力起着限制释放铁速率关键步骤的观点,建立分析铁蛋白释放铁的动力学特性方程并用它较合理地阐明铁蛋白释放铁的动力学规律及储存铁的途径。用分光光度法和动力学方程研究细菌铁蛋白释放铁的全过程,其结果表明该蛋白以一级反应方式释放铁核表层的铁和以零级反应方式释放铁核内层的铁。外加磷酸盐能强烈地抑制释放铁的速率,引起释放铁的反应级数的转化,迫使铁蛋白以一级反应的方式释放铁核中的大多数铁。     

极端微生物产碱性蛋白酶菌株的筛选及发酵条件研究

从深海的38份水样和泥样中筛选到一株产蛋白酶的菌株DY－A,其最适生长温度为10℃,能适应较大范围的pH值和盐度,此菌株只在酵母膏存在的情况下产酶,不利用单一氮源,最适产酶条件为,pH10.0,10℃,接种量0．5％,200r/min摇床培养40－72h,粗酶液的最适作用温度为40℃,最适pH值为10,在pH9-12内稳定,是一碱性蛋白酶。     

有机碳对海洋着色菌YL28去除无机三态氮的影响

【目的】在无机三态氮(氨氮、亚硝氮和硝氮)共存的模拟海水水体中,阐明有机碳尤其是海藻寡糖对海洋着色菌(Marichromatium gracile)YL28生长及去除无机三态氮的影响规律。【方法】采用次溴酸钠氧化法、N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法和紫外分光光度法分别测定水体中氨氮、亚硝氮和硝氮的含量,菌体生物量采用比浊法测定。【结果】在光照厌氧环境中,小分子有机酸盐(乙酸钠、丙酮酸钠、琥珀酸钠和柠檬酸钠)是YL28生长和去除无机三态氮的良好有机碳,亚硝氮、硝氮和氨氮去除率分别达到97.92%、99.98%、73.23%-87.15%。单糖(葡萄糖和果糖)、双糖(麦芽糖和蔗糖)和寡糖(壳寡糖和海藻寡糖)是YL28可利用的有机碳,亚硝氮和硝氮去除率分别达到99%和87%以上,氨氮去除率在44.82%-54.53%之间。多糖(β-环糊精、淀粉、黄原胶、琼脂粉、海藻酸钠和卡拉胶)不是菌体利用和去除无机三态氮的有机碳。酵母提取物可作为菌体生长、去除硝氮和亚硝氮的良好有机碳,但严重抑制氨氮去除。海藻酸钠、β-环糊精和卡拉胶分别与乙酸钠共存时,YL28生长和对无机三态氮去除能力与乙酸钠为唯一有机碳的水平相当。乙酸钠体系中添加海藻寡糖,YL28生长速率、最大生物量以及氨氮的去除速率和最大去除率均升高,添加酵母提取物时,生长速率和最大生物量升高,但氨氮去除速率和最大去除率降低。黑暗厌氧环境下,以乙酸钠和氨氮为唯一有机碳和氮源时,YL28不生长,但在无机三态氮共存时,则能良好生长并去除无机三态氮。【结论】在无机三态氮共存海水体系和厌氧条件下,无论是光照还是黑暗环境,YL28均能良好地生长和去除无机三态氮,小分子有机酸盐(乙酸钠、丙酮酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠)是其良好的有机碳,相对而言,乙酸钠和丙酮酸钠更好。海藻寡糖与乙酸钠复合可提高菌体生长和脱氮能力。本研究为研制开发高效脱氮微生物制剂及其合理性应用提供了指导。     

深海太平洋火色杆菌琼胶降解基因分析和琼胶酶Aga0950的表达及酶学性质

【目的】对深海太平洋火色杆菌(Flammeovirga pacifica WPAGA1)全基因组进行生物信息学分析,筛选获得琼胶酶基因aga0950,采用基因工程手段对该基因的功能和性质进行验证和分析。【方法】采用Illumina HiSeq2500测序技术进行基因组测序分析;采用克隆表达和镍柱纯化方法获得纯aga0950基因表达产物;采用薄层层析(TLC)和离子色谱(IC)法分析酶降解琼胶产物;采用二硝基水杨酸法(DNS)测定琼胶酶活性。【结果】基因组序列分析表明,菌株WPAGA1全基因组拥有13个β-琼胶酶相关基因;氨基酸序列比对显示,同源性为60%–85%,其中aga0950是具有GH16家族典型特征的基因,同源性为67%。纯化的重组酶Aga0950比活力达51770 U/mg,具有高效降解琼胶活性,降解终产物为新琼四糖和新琼六糖;最适温度为50°C,最适pH为4.0–10.0;Co~(2+)、Mn~(2+)和Fe3+促进酶活,Cu~(2+)抑制酶活。【结论】深海菌株WPAGA1具有丰富的琼胶酶基因;属于GH16家族的琼胶酶基因aga0950表达产物具有高效降解胶琼活性和良好的热、酸、碱稳定性。     

需钠弧菌WPAGA4菌株3条琼胶酶基因克隆、表达与酶学性质分析

【目的】本文拟从西太平洋深海沉积物中分离得到的需钠弧菌(Vibrio natriegens) WPAGA4菌株中克隆并表达3条β-琼胶酶基因agaW3418、agaW3419和agaW3472,并对其酶学性质进行研究。【方法】通过克隆表达技术将得到的3条琼胶酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中进行表达,通过二硝基水杨酸(DNS)法测定重组琼胶酶的酶活,并对其中活性最优的一种琼胶酶进行热稳定性和产酶条件优化。【结果】三种琼脂酶均为属于GH50家族。AgaW3418、AgaW3419和AgaW3472在温度分别为50、60和30℃以及pH值分别为6.0、7.0和7.0条件下,发挥作用的能力最强。其中琼胶酶AgaW3472表现出最优的酶活性质,在20℃下保持良好的稳定性,且在SOB (super optimal broth)培养基条件下以1%(质量体积分数)的乳糖作为碳源,同时添加20 mmol/L MgCl2,并将诱导温度和异丙基-1硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-1 thio-β-D-galactoside, IPTG)浓度分别设置为37℃和0.1 mmol/L时能够获得...     

极端微生物产碱性蛋白酶菌株的筛选及发酵条件研究*

从深海的 3 8份水样和泥样中筛选到一株产蛋白酶的菌株DY A ,其最适生长温度为1 0℃ ,能适应较大范围的pH值和盐度。此菌株只在酵母膏存在的情况下产酶 ,不利用单一氮源 ,最适产酶条件为 :pH1 0 0 ,1 0℃ ,接种量 0 5 % ,2 0 0r/min摇床培养 48～ 72h。粗酶液的最适作用温度为 40℃ ,最适pH值为 1 0 ,在pH9～ 1 2内稳定 ,是一碱性蛋白酶。     

棕色固氮菌细菌铁蛋白释放铁的动力学方程和性质

棕色固氮菌细胞铁蛋白铁核中的磷铁组成存在非均匀性。细菌铁蛋白释放铁的动力学特性表现出复杂性。通过动力学曲线分析,提出蛋白壳自身调节能力起着限制释放铁速率关键步骤的观点建立分析铁蛋白释放铁的动力学特性方程并用它较合理地阐明铁蛋白释放铁的动力不储存铁的途径。用分光光度法和动力学方程研究细胞铁蛋白释放铁的全过程。其表明该蛋白以一级反应方式释放铁核表层的铁和以零级反应方式释放铁核内层的铁。外加磷酸盐能强烈     

深海细菌的分子鉴定分类

从东太平洋海底 5,30 0m深的沉积物中分离到一批嗜冷细菌 ,克隆了其中 1 3株细菌的1 6SrRNA基因 ,通过其序列的测定和比较 ,对这 1 3株细菌进行了分子鉴定 ,结果表明它们分属于副球菌 ,假单胞菌 ,盐单胞菌和假交替单胞菌 4个不同的菌属 ,同时进行了系统发育分析。     

南极耐冷 Pseudomonas sp. 7323低温脂肪酶的性质及基因克隆

 南极微生物是筛选低温酶的良好来源,但尚未得到充分的研究与开发.低温脂肪酶具有广阔的应用前景,其基因结构特征也具有重要的研究意义. 本文对南极微生物开展了低温脂肪酶产生菌的筛选、基因克隆及特征分析.采用功能筛选的方法,从南极普里兹湾深海沉积物中获得一株产低温脂肪酶的菌株7323,其最适温度和最高生长温度分别为20℃和30℃,属于耐冷菌.16S rDNA序列分析表明,该菌属于假单胞菌属（Pseudomonas）.通过设计引物扩增出的脂肪酶基因全长为1854　bp,该基因编码一个由617氨基酸、分子量预计为64466的蛋白质.氨基酸序列分析表明,该酶与Pseudomonas sp. UB48 的脂肪酶有89%的相似性,在催化区和C末端信号肽中存在高度保守的序列.纯化后的酶学性质研究表明,该脂肪酶的最适温度为35℃,最适pH值为9.0,为碱性低温酶.