基于转录组测序分析甜菜夜蛾卵巢细胞离体培养成系进程

【目的】本研究旨在分析甜菜夜蛾Spodoptera exigua蛹卵巢细胞建立细胞系的整个过程,探究细胞由体内到体外培养过程中其基因表达在转录水平的变化,为昆虫体外培养模型的建立提供理论基础。【方法】利用Illumina Hiseq测序平台对甜菜夜蛾蛹卵巢细胞离体培养过程中各阶段的细胞分别进行转录组测序,对获得注释的差异表达基因及其相关信号通路进行分析;通过荧光定量PCR对部分细胞周期相关基因(cycd和cdk4)、调控基因(cdc20,apc1,skp2和mad1)、增殖相关分子标志物(mcm4和pcna)在甜菜夜蛾卵巢细胞离体培养过程中的转录进行验证。【结果】甜菜夜蛾蛹卵巢细胞离体培养过程包括5个阶段:解剖获得离体的卵巢组织,卵巢组织贴壁培养后游离出原代细胞,细胞转化重新具备增殖能力,成功首次传代,以及能够连续传代15代以上建立细胞系。上述5个阶段的细胞经转录组测序、数据组装后共获得46 796条unigenes序列,组装得到序列长度完整性好;转录本unigenes序列拼接长度分布合理,样本碱基Q30均在94%以上。通过KEGG数据库获得注释的unigenes有1 473条,参与细胞过程紧密相关的20条信号通路,其中有92条unigenes在细胞周期信号通路中获得注释。聚类分析表明,在体内处于快速发育状态的卵巢细胞与同样处于增殖状态的细胞系基因表达模式非常接近。原代细胞由短暂停滞生长至成簇细胞的转化关键期,筛选到差异表达基因619个,cdk4在离体培养期表达量显著降低,cycd在细胞转化关键期之后表达量显著升高,cdc20,apc1,skp2和mad1在卵巢组织和细胞系的表达量显著高于原代细胞、转化关键期细胞和首次传代细胞的。从原代细胞至传代后,cycd的表达显著升高8.7倍,显著高于mcm4和pcna的变化水平。【结论】甜菜夜蛾卵巢细胞离体培养过程中5个阶段的细胞转录组测序获得的序列质量符合数据分析的基本要求。筛选获得了甜菜夜蛾蛹卵巢细胞经离体培养过程中的差异表达基因。原代细胞逆转增殖可能与cdk4,cycd,skp2和mad1等细胞周期调控基因表达有关。另外,cycd可作为原代细胞具备传代能力的标志物。     

小金蝠蛾幼虫血细胞的种类、形态及细胞免疫功能

【目的】本研究旨在鉴定小金蝠蛾Thitarodes xiaojinensis幼虫血细胞类型,统计各类血细胞所占比例并检测其细胞免疫能力。【方法】利用光学相差显微镜观察小金蝠蛾7龄幼虫血细胞,并根据鳞翅目昆虫血细胞特有形态对小金蝠蛾幼虫血细胞进行鉴定;利用96孔板对小金蝠蛾各类血细胞进行计数并计算各类血细胞所占的比例;利用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae以及Congo Red染色的DEAE-Sephadex A-25凝胶珠刺激小金蝠蛾7龄幼虫,检验其细胞免疫反应。【结果】小金蝠蛾幼虫血细胞由粒细胞、浆细胞、珠血细胞和类绛色细胞组成,所占比例分别为62.5%,26.6%,10.1%和0.8%,未发现典型的原血细胞。酿酒酵母刺激结果显示,小金蝠蛾幼虫血细胞可以发生吞噬以及结节反应。Congo Red染色的DEAE-Sephadex A-25凝胶珠刺激结果显示,小金蝠蛾幼虫血细胞可以发生包囊反应。【结论】小金蝠蛾幼虫血细胞组成及其形态与其他鳞翅目昆虫一致,其中粒细胞所占的比例最高。小金蝠蛾幼虫血细胞对酿酒酵母刺激敏感,可发生吞噬和结节反应,对Congo Red染色的DEAE-Sephadex A-25凝胶珠刺激敏感,可发生包囊反应。小金蝠蛾细胞免疫功能完善。     

亚硒酸钠对弥漫性大B细胞淋巴瘤SU-DHL-4细胞的干预作用及其机制*

目的: 证实亚硒酸钠对弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的作用,并分析其作用的分子机制。方法: 分别用0、2、10、50和250 ng/ml亚硒酸钠作于96孔培养板培养24 h 的DLBCL细胞SU-DHL-4,用CCK-8法检测DLBCL细胞的增殖活性,hoechst染色和流式细胞术分析SU-DHL-4细胞的核形变化、凋亡和坏死率,RT-qPCR和Western blot法检测该细胞基因转录、表达和活化情况。结果: 亚硒酸钠可显著抑制SU-DHL-4细胞增殖活性并诱导其凋亡,抑制基因RIP2、Bcl-xL、NIK及NF-κB的表达,同时可以使SU-DHL-4细胞内RIP2、Bcl-xL、NIK、P52蛋白表达水平明显下调,并促进Caspase-3的磷酸化。结论: 亚硒酸钠可通过影响NF-κB经典和非经典通路,从而抑制SU-DHL-4细胞的增殖,并诱导其发生凋亡。     

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒在宿主草地贪夜蛾选择压力下的毒力和基因变异

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)原产北美,现已入侵中国许多地区,造成了巨大的生态和经济损失.杆状病毒是多种昆虫的病原体,对非目标生物无毒无害,是很有应用前景的生物农药,其施用可大大减缓草地贪夜蛾对化学农药抗性产生速度.以往的研究发现,虽然苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)可感染许多种鳞翅目昆虫,但对草地贪夜蛾口服感染能力较差.选择毒力增强的变异体是提高AcMNPV作为病毒杀虫剂应用的一个新方向.在本研究中,使用野生型AcMNPV在草地贪夜蛾2龄末幼虫中连续传代20次,并对亲本和后代分离株的毒力进行了评价.与野生型AcMNPV相比,后代分离株对草地贪夜蛾2龄末幼虫毒力显著提高.由于病毒的复制依赖于宿主细胞,受到草地贪夜蛾选择压力的影响,AcMNPV的基因发生变异.宿主适应性强的毒株在草地贪夜蛾体内的感染增殖能力较强,容易获得生长优势并成为优势毒株.更进一步,本研究通过二代测序分析了突变的关键基因.本研究可为生物农药生产提供高毒力毒株,也可在草地贪夜蛾应急防控和持续防控中发挥重要作用.