PBI-SUR-TK载体靶向介导HSV-TK自杀基因诱导肝癌细胞凋亡

目的:构建Survivin启动子调控的表达载体,并检测在启动子调控下HSV-TK自杀基因对肝癌细胞HepG₂和正常肝细胞HL-7702凋亡的影响。方法:合成含TK基因的质粒PBI-SUR-TK,利用脂质体Lipofectamine 2000将其导入肝癌细胞和肝细胞。然后分别运用RT-PCR和Western blot特异性检测基因和蛋白的表达情况;利用CCK8方法检测细胞增殖情况,流式细胞仪上机检测细胞凋亡情况。结果:肝癌细胞转染组有更多的TK基因表达产物,增殖情况减弱,凋亡情况明显。结论:Survivin启动子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌可能有一定的治疗作用。     

新型神经保护肽[Gly14]-Humanin的表达，纯化和活性鉴定

Humanin（HN）是近年来在人体内发现的内源性多肽,能够保护神经细胞免于各种阿尔采默病病相关因素诱导的凋亡,HN肽链第14位氨基酸被Gly取代的突变体[Gly14]-Humanin（HNG）,神经保护活性比HN高近1 000倍。但由于HNG天然获取的途径有限,限制了对其功能的进一步研究。本课题组构建了HNG的表达质粒pET32a/HNG,并将其转化大肠杆菌BL21 trxB (DE3),诱导表达后HNG以可溶性融合蛋白的形式出现并用镍离子亲和层析纯化,纯化的融合蛋白用肠激酶切割后经反相层析得到纯化的HNG多肽（23 mg每1 L细菌培养液）,重组HNG多肽的分子量经电喷雾电离质谱（ESI-MS）检测为2876.5道尔顿,其N末端8个氨基酸残基的序列经Edman降解法测定为A-M-M-A-P-R-G-F,均与理论值一致。神经细胞保护实验表明,重组HNG多肽的神经保护作用与天然的HNG相近     

人多能干细胞来源的肾定向分化平台的构建

肾是一种重要的人体器官,具有多种生理功能。然而,全球范围内约有10%的人口患有肾疾病。因此,建立一种接近人体肾的结构与功能的模型进行肾疾病的研究是十分必要的。多能干细胞体外定向诱导分化技术的兴起,为再生医学和精准医学领域注入了新的动力。本研究通过在体外条件下模拟体内肾发育的过程,将人多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞,通过体外定向诱导分化形成肾的祖细胞,进而建立肾的结构与功能单位:肾元。该研究通过激活WNT信号通路,同时抑制TGF-β信号通路,将人多能干细胞从多能态定向诱导至原条阶段。之后通过细胞自分化的能力使其发育至中间中胚层,再通过激活FGF信号通路,将其分化至肾祖细胞阶段。流式细胞检测结果显示,肾祖细胞占总细胞数的51.5%~61.9%。通过免疫荧光检测发现:分化得到的结构中包含肾小球足细胞、近端小管、远端小管等肾组织结构。该研究建立的肾体外分化方法,具有稳定性好、分化效率高、重复性好的特点。为研究人类肾的早期发育机制,肾疾病模型构建,以及药物筛选提供了一种新的方法。     

人胰岛素突变体GIRR的分离纯化及性质研究

构建人胰岛素原突变体GIRR(A2 1Asn→Gly,B1 7Leu→Ile ,B31Arg ,B32Arg)基因的原核融合表达载体并进行表达和纯化 ,进一步对其性质进行研究。将人胰岛素原突变体基因重组到pTXB1融合表达载体上 ,在E .coliBL2 1 (DE3)中得到高效表达。表达产物经几丁质亲和柱层析分离以及胰蛋白酶和羧肽酶B的酶促转化等步骤 ,得到纯的人胰岛素突变体GIRR ,其纯度经HPLC鉴定达到 95 % ,氨基酸组成和设计相符 ,其受体结合活性是猪胰岛素的 1 0 5 % ,生物活性为 2 6.8IU/mg。其血浆半衰期为 2 0分钟 ,比标准猪胰岛素提高 3倍多。结果提示本突变体具有更长的半衰期 ,为长效胰岛素的制备提供了新的思路。     

肝细胞特异性基因治疗载体的构建及活性研究

以细胞膜穿透肽 (Penetratin)基因为主要模板序列 ,融合肝细胞膜受体结合蛋白的DNA序列 ,设计一段肝细胞基因治疗载体的特异基因序列 ,构建并表达了肝细胞特异性载体体系及 3种对照体系。然后进行肝细胞的穿膜实验 ,细胞荧光显色结果提示肝细胞特异性载体体系可以有效地介导外源蛋白EGFP的基因进入肝细胞 ,并在肝细胞内表达。结论提示 ,所构建的载体体系有可能为肝细胞基因治疗提供一种新型的非病毒基因治疗载体。