肥胖及2型糖尿病大鼠Alzheimer病样Tau蛋白过度磷酸化修饰及机制探讨

Tau蛋白异常过度磷酸化修饰在阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)发病机理中起非常重要的作用,而2型糖尿病是AD的风险因素之一.采用蛋白质印迹研究2型糖尿病及单纯肥胖大鼠脑中海马回tau蛋白磷酸化程度,发现在这两种大鼠模型中海马tau蛋白在多个位点上都呈现过度磷酸化状态.同时,胰岛素信号传导系统中的关键酶糖原合成激酶-3β(glycogensynthasekinase-3β,GSK-3β)活性在这两种大鼠模型的海马回中明显增高,经脑立体定位法向大鼠海马回注射GSK-3β抑制剂氯化锂(LiCl),可阻止2型糖尿病及肥胖大鼠模型中的GSK-3β激活,但仅阻止单纯肥胖大鼠海马回tau蛋白过度磷酸化.另外,海马神经细胞膜上胰岛素受体β亚基水平在两种实验模型中显著下降.研究结果表明,2型糖尿病及肥胖可能通过增高胰岛素抵抗,从而导致GSK-3β激活和tau蛋白的过度磷酸化来提高AD的发病风险.2型糖尿病脑中低下的葡萄糖代谢也可能在tau蛋白的过度磷酸化起一定作用.     

1型糖尿病葡萄糖代谢与胰岛素信号传导途径异常导致大鼠海马Alzheimer样tau蛋白过度磷酸化修饰

Tau蛋白过度磷酸化是Alzheimer病(Alzheimer disease, AD)的一个重要病理特征.采用 I 型糖尿病大鼠模型,研究胰岛素信号传导途径及葡萄糖代谢失调对tau蛋白过度磷酸化的形成机制进行探讨.以同龄Wistar大鼠做对照（CTL）,胰腺大部分切除造低胰岛素组（PX）,STZ较大剂量一次性注射造1型糖尿病模型即低胰岛素高血糖组（T1DM）.葡萄糖氧化酶法检测血浆血糖,放免法检测血浆胰岛素,蛋白质印迹分析海马内总tau蛋白及tau蛋白上部分位点（Ser199、Thr212、Ser214、Ser396及Ser422）的磷酸化及神经细胞膜上葡萄糖转运子3（Glucose transport 3,GLUT3）水平.γ-32P-ATP和特异性底物肽检测海马内胰岛素信号传导系统中的关键酶糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）活性.发现3组大鼠海马回总tau蛋白水平无显著差异,但以高血糖、低胰岛素血症为特征的T1DM组在tau蛋白Ser199、Thr212、Ser214、Ser396及Ser422位点上,呈现过度磷酸化状态,以低胰岛素血症为特征而血糖正常的PX组在位点Ser199、Thr212及Ser396上磷酸化程度比CTL组显著上升, 在位点Ser214及 Ser422上的磷酸化程度的改变不显著;T1DM及PX组大鼠海马 GSK-3β活性显著高于CTL组, 而GLUT3水平在T1DM和PX组均降低, 尤以T1DM组降低更显著.研究结果显示,胰岛素水平低下可能通过激活GSK-3β和下调细胞内葡萄糖代谢的双重作用引起脑内tau蛋白过度磷酸化.     

蛋白磷酸酯酶2A调节微管相关蛋白1b的磷酸化

微管相关蛋白MAP1b的生物学活性受其磷酸化修饰的调节,后者则受相应的蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶(PP)调控.为研究蛋白磷酸酯酶在脑内对MAP1b磷酸化的调控作用,采用有代谢活性的大鼠脑片作为模型,分别应用冈田酸(okadaic acid)和cyclosporin A选择性地抑制PP2A 和PP2B活性,来研究其对脑内蛋白磷酸酯酶MAP1b磷酸化的调控.采用特异性的MAP1bⅠ型磷酸化依赖性抗体522和免疫印迹技术检测MAP1bⅠ型磷酸化.结果表明,当PP2A被okadaic acid选择性抑制后,MAP1bⅠ型磷酸化明显增加.而PP2B被选择性地抑制后,MAP1b磷酸化的变化不大.免疫组化染色显示,MAP1b广泛分布于鼠大脑神经元和突起中,与对照组相比,在PP2A抑制的脑片中抗体522的免疫活性在神经元中明显升高.上述结果表明,PP2A是脑中调控MAP1bⅠ型磷酸化的主要蛋白磷酸酯酶.     

蛋白磷酸酯酶对Alzheimer神经原纤维缠结的松解作用

神经原纤维缠结是Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ患者的特征性脑病理损伤,其形成机制至今不明．根据神经原纤维缠结的基本组分是异常磷酸化ｔａｕ蛋白的聚集形式双螺旋丝（ｐａｉｒｅｄｈｅｌｉｃａｌｆｉｌａｍｅｎｔｓ,ＰＨＦ）的研究结果,推测蛋白磷酸酯酶与蛋白激酶的失衡可能与ＰＨＦ的形成有关．将蛋白磷酸酯酶ＰＰ－２Ａ和ＰＰ－２Ｂ与ＰＨＦ一起在３７℃保温３０ｍｉｎ可使ＰＨＦ缠结结构松解,成为单个ＰＨＦ原纤维,延长去磷酸化反应时间至３ｈ可使ＰＨＦ结构进一步松解,释放一些游离ＰＨＦ原纤维片段．放免印迹定量分析结果表明：ＰＰ－２Ａ处理的ＰＨＦ样品比对照者释放游离ｔａｕ蛋白的量增加２５％．此外,ＰＰ－２Ａ和ＰＰ－２Ｂ去磷酸化的ＰＨＦ对脑中钙激活的中性蛋白水解酶的抗性降低．这些研究资料从结构上显示了Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病脑病理损伤的可逆性,为Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病治疗的可能性提供了实验依据     

缺血性脑血管病变组织中葡萄糖转运蛋白1的改变

葡萄糖通过血脑屏障从血液中进入脑组织必须依赖葡萄糖转运蛋白(glucose transporter,GLUT)的帮助.GLUT1是血脑屏障上最主要的GLUT,也是脑毛细血管壁内皮细胞的分子标记.动物研究显示在急性脑缺血后脑内的GLUT1表达增加.检测了7例慢性微血管缺血性脑血管病变(ischemic cerebrovascular diseases,ICVD)的尸检脑组织中的GLUT1水平,并与11例同龄对照组比较.结果发现GLUT1水平在ICVD组中降低.其降低可能是由于低氧诱导因子-1α(hypoxia-induciblefactor-1α,HIF-1α)的下调所致.但是,在ICVD脑组织中的GLUT1水平降低不伴随有蛋白质O-GlcNAc糖基化水平的下降.上述结果为探讨脑缺血病变的机理提供了新线索.     

蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰对tau蛋白磷酸化修饰的影响

蛋白质的O位N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)糖基化修饰是一种新近发现的广泛存在于细胞核蛋白与细胞浆蛋白的蛋白质翻译后修饰.其性质与经典的膜蛋白和分泌蛋白的糖基化修饰不同,而与蛋白质磷酸化修饰更相似.O-GlcNAc糖基化和磷酸化均修饰tau蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基,通过改变O-GlcNAc糖基化供体底物浓度以及其关键酶活性等方法,改变分化后成神经细胞样的PC12细胞中的蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰水平,然后用特异性识别不同位点磷酸化的tau蛋白抗体,进行蛋白质印迹分析来检测tau蛋白磷酸化水平的变化.结果发现细胞内蛋白质O-GlcNAc糖基化对tau蛋白磷酸化的影响,在不同的磷酸化位点其影响不同.增加蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰导致tau蛋白大多数磷酸位点的磷酸化水平降低,反之亦然.这些结果说明,tau磷酸化在大多数位点受到O-GlcNAc糖基化修饰的负性调节.这一研究为阐明调节tau蛋白磷酸化水平的机理和阿尔茨海默病脑中tau异常过度磷酸化的分子机制提供了新的线索.     

罗格列酮改善胰岛素抵抗大鼠海马Alzheimer病样tau蛋白磷酸化水平

Tau蛋白过度磷酸化是Alzheimer病(AD)发病的关键事件.由于2型糖尿病是AD的风险因子,并且胰岛素抵抗是2型糖尿病的特征,检测了胰岛素抵抗大鼠大脑海马tau蛋白磷酸化水平,以及运用胰岛素增敏剂罗格列酮(TZD)后磷酸化的变化,发现胰岛素抵抗组大鼠海马tau蛋白呈过度磷酸化改变,但运用TZD后,tau蛋白的磷酸化状态有所恢复.由于糖原合成激酶-3β(GSK-3β)位于胰岛素信号转导途径中,并且是tau蛋白的重要磷酸激酶,研究检测罗格列酮干预前后GSK-3β活性,发现均升高.研究结果表明,肥胖时胰岛素抵抗导致细胞内胰岛素信号转导途径中,GSK-3β活性上调可能是引起大鼠海马内tau蛋白过度磷酸化的一个重要原因;虽然TZD可抑制tau蛋白的过度磷酸化,但可能不是通过下调GSK-3β活性的途径.     

血清胆碱酯酶同工酶的分离及其同工酶谱

 本文建立了分离SChE同工酶的聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法,较其他方法简便,分辩力高且结果更清晰。本文对ChE抑制剂,血液抗凝剂和血清貯存时间对SChE同工酶谱的影响进行了研究,同时分离检测了39例正常人和38例肝损害者的SChE同工酶谱及其各带的相对百分活性。正常人均可分出9条同工酶带,部分人有10条(46.2％)和11条(15.4％),说明中国人存在SChE群体变异。肝损害患者的SChE带2—5的活性明显减弱甚至消失,可用于临床诊断。     

微管相关蛋白tau在动物死亡后被快速去磷酸化

tau蛋白是神经细胞中主要的微管相关蛋白, 它的异常过度磷酸化被认为是阿尔茨海默病 (AD) 致病过程中的关键因素. 由于法律、社会、家庭等诸多因素使得获取的人脑组织标本常常在死亡后2~3 h以上,因此了解死亡不同时间后tau蛋白磷酸化的改变,对研究tau蛋白的功能及在AD致病过程中作用显得十分重要. 用位点特异的、磷酸化依赖的抗tau蛋白抗体检测正常大鼠脑中tau蛋白磷酸化程度及死亡后其磷酸化的变化情况,再用非同位素的点印迹技术测定鼠脑中tau蛋白激酶、磷酸酶在不同温度下的活性. 结果发现,正常鼠脑中tau蛋白除了Ser262,Ser409,Ser422外,在Thr181,Ser199,Ser202,Thr205,Thr212,Ser214,Thr217,Ser396和Ser404存在不同程度的磷酸化,并且在死亡后3 h,出现tau的多位点的去磷酸化及tau蛋白迁移加快,6 h后更为明显,但tau蛋白水平即使在大鼠死亡后6 h,仍未见有明显的改变. 用点印迹测定蛋白激酶和磷酸酶活性结果显示,tau蛋白激酶、磷酸酶活性均有温度依赖性降低,在25℃时激酶活性降低远大于磷酸酶活性的降低,tau蛋白在死亡后的快速去磷酸化与相对高的磷酸酶作用有关.