一步RT-PCR检测水仙黄条病毒

目的:建立用于快速检测水仙黄条病毒(Narcissus yellow stripe virus,NYSV)的一步RT-PCR方法。方法:根据已报道的NYSV基因序列设计特异性引物,采用一步RT-PCR建立了快速检测水仙黄条病毒的方法。结果:该方法具有良好的特异性,能够从感染水仙黄条病毒的水仙样品上扩增出预期大小的特异性目的片段,而与其他病毒无交叉反应;一步RT-PCR产物序列测定结果表明,该产物的序列与NYSV序列高度同源,同源性达99%;灵敏度测定结果显示,一步法RT-PCR与两步法RT-PCR的灵敏度相当,可以检测稀释到10-4倍的RNA。结论:应用建立的一步RT-PCR对一批水仙样品进行NYSV检测,结果与两步法RT-PCR完全相同,说明该方法可准确用于NYSV的检测。     

呼肠孤病毒科的系统发育分析

运用邻接法(neibor-joining,NJ)、最大似然法(maximum likehood,ML)对国际病毒分类委员会(Intemational Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)第八次报告中所有已报道的呼肠孤病毒科外层衣壳蛋白序列进行了系统发育分析.结果表明:两种方法构建的系统树拓扑结构基本一致,尽管部分分支略有差异,但都能够反映出科内各属的系统发育关系,分析结果支持了该科的分类地位.同时还比较两种建树方法的异同点,并对建树产生的差异原因作了探讨.     

不同寄主来源的马铃薯Y病毒群体遗传结构的比较分析

文章以马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY) P3和pipo基因为分子标记,比较分析烟草和马铃薯两个寄主的PVY遗传多样性和群体分化,并评估突变、选择、基因流等遗传力所起的作用。通过P3和pipo基因计算获得的烟草和马铃薯群体分化指数F_ST分别为0.116和0.120,且统计检验差异显著,表明烟草和马铃薯寄主的PVY之间中度分化。变异分析结果显示,烟草分离物P3和pipo基因的核苷酸序列一致性分别为85.2%~100%和76.5%~100%,而马铃薯分离物的P3和pipo基因的核苷酸序列一致性分别为95.7%~100%和93.0%~100%,表明烟草PVY变异程度高于马铃薯。同时,P3基因内检测到大量的净化选择位点,表明该基因大部分位点的变异为有害突变,在进化过程中被剔除。此外,P3基因内还检测到两个显著正向选择位点,表明这两个位点的变异为有益突变,有利于病毒的生存竞争。在pipo基因中未检测到显著的选择位点,表明该基因上的变异基本不受自然选择影响。通过P3和pipo基因计算烟草和马铃薯群体间的基因流Nm值分别为1.91和1.83,表明这两个群体间存在较强的基因交流。以上结果表明,来源于烟草和马铃薯寄主的PVY遗传差异显著,突变、自然选择以及基因流都影响两者的遗传多样性及遗传分化程度。     

马铃薯Y病毒pipo基因的分子变异及结构特征分析

为揭示马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY) pipo基因的分子变异和结构特征, 文章根据文献报道的马铃薯Y病毒属(Potyvirus) pipo 基因保守区序列设计一对简并引物, 从感染PVY的马铃薯病叶中克隆获得pipo基因的cDNA全长序列, 分析其核苷酸序列和氨基酸序列的特征, 并基于氨基酸序列使用贝叶斯法重建了Potyvirus的系统发育树。结果显示：20个PVY分离物成功扩增出预期大小(约235 bp)的特异性片段, 其核苷酸序列与已报道的其它PVY 株系的pipo基因核苷酸序列一致性均在92%以上; 5′端均含有典型的G1-2A6-7 基序(motif), 无碱基插入/缺失, 所有的核苷酸变异都是碱基置换, 共发现13个多态性位点, 其中4个简约信息位点, 9个单一变异位点, 表明该基因高度保守, 但不同分离物也存在一定的分子变异; PIPO蛋白理论等电点11.26~11.62, 无信号肽和跨膜区, 是可溶的亲水性蛋白; 整个蛋白含有3个保守区, 其中位于10~59aa的基序最为保守。该蛋白主要定位于线粒体中, 可能是线粒体导肽。系统发育分析结果显示, 源于PVY不同株系优先相聚成簇, 而向日葵褪绿斑驳病毒(Sunflower chlorotic mottle virus, SuCMoV)与辣椒重花叶病毒(Pepper severe mosaic virus, PepSMV)的亲缘关系较PVY相比更近, 与前人的结果相一致, 表明PIPO蛋白可以作为研究Potyvirus系统发育关系的新的分子标记。     

水稻瘤矮病毒P8蛋白的结构分析及其表达

为揭示水稻瘤矮病毒(RGDV)外层衣壳蛋白P8的结构特点及其在大肠杆菌中的表达特性。利用生物学软件和在线分析工具,对RGDV P8蛋白结构特征进行了生物信息学分析;同时将通过RT-PCR扩增的P8基因克隆到pGEX-4T-1上,构建pGP8转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下表达。利用表达的融合蛋白免疫家兔,制备了抗血清,并以RGDV、水稻矮缩病毒(RDV)、水稻条纹病毒（RSV）、水稻锯齿叶矮缩病毒(RRSV)4种病毒作为供试材料进行特异性检测。分析显示P8蛋白在C端位置有一个典型的跨膜螺旋区,整个蛋白也具有Phytoreo P8家族共有的典型结构域Phytoreo P8 domain。SDSPAGE和蛋白印记分析表明,RGDV P8融合蛋白分子量约为73kDa,以包涵体的形式获得了高效表达。获得的效价高、特异性强的抗血清,为水稻瘤矮病毒的快速检测及P8蛋白的功能研究奠定了基础。     

马铃薯Y病毒福建分离物P1基因的分子变异和结构特征

为揭示马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)P1基因的分子变异及结构特征, 并查明福建分离物P1基因的变异来源。文章设计一对简并引物从感染PVY的马铃薯病叶扩增、克隆获得福建分离物P1基因的cDNA全长序列, 分析其核苷酸序列和氨基酸序列的特征, 并采用贝叶斯法重建P1基因的系统发育树。结果显示, 12个福建分离物均成功扩增出预期大小(约915 bp)的特异性片段, P1基因的核苷酸序列与已报道的PVY不同株系的核苷酸序列一致性为73%~99%; QK44、XT02、XT08、LH05分离物的309 nt位置均检测到一个强烈的重组信号。12个PVY分离物中, P1蛋白有85个变异的氨基酸位点, 表明其高度变异; P1蛋白的第41~275位是一个高度保守的结构功能域, 含有3个保守的活性位点(H₁₉₂、D₂₀₁、V₂₃₅); 系统发育分析显示, 福建分离物形聚为3种不同的簇, 其对应的卷曲结构(Coiled-coil domain)和空间结构也不相同, 表明不同株系型的P1基因在系统发育关系上分化较大。该研究结果表明PVY P1基因在核苷酸序列、氨基酸序列以及空间结构具有高度变异性, 但行使P1蛋白功能的活性位点所在的氨基酸(H₁₉₂、D₂₀₁和V₂₃₅)均高度保守; 福建分离物P1基因的变异源主要来自碱基突变和基因重组。     

马铃薯Y病毒多基因系统发育分析及其在株系鉴定中的应用

为实现马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)常见株系的快速鉴定,本文以PVY的P1、HC-pro、VPg和CP 4个基因为研究对象建立了快速准确的多基因联合体系。根据基因的不同组合建立5个不同数据集,分别进行系统发育分析,并通过贝叶斯标签关联显著性(Bayesian tip-association significance, BaTS)分析各数据集中代表分离物与株系的关联性,以确定实现PVY快速鉴定的最佳组合。不同数据集的系统发育及BaTS分析结果显示,除了联合P1、VPg和CP 3个基因数据集外,其他4个数据集均无法实现PVY常见株系的准确鉴定。采用不同建树方法对联合P1、VPg和CP 3个基因数据集比较分析显示,基于ML法和NJ法的系统发育树在拓扑结构上基本一致,均优于基于贝叶斯算法的最大分支置信(maximum clade credibility, MCC)树。同时,以HLJ26分离物为研究对象,对建立的多基因联合体系进行实际应用,结果显示该分离物与PVY^NTN-NW株系的3个分离物SYR-Ⅱ-2-8、SYR-Ⅱ-Be1和SYR-Ⅱ-DrH以高置信值聚为一亚簇,表明该分离物可能属于PVY^NTN-NW株系(SYR-Ⅱ型)。重组分析显示,HLJ26基因组存在4个潜在的重组信号,分别位于P1、HC-pro/P3、VPg和CP的5°-末端,与PVY^NTN-NW株系(SYR-Ⅱ型)的重组位点相一致,表明其属于PVY^NTN-NW株系(SYR-Ⅱ型)。同时,应用多重RT-PCR成功扩增出约为1000 bp和400 bp的2个特异性片段,与PVY^NTN-NW株系(SYR-Ⅱ型)的特异条带大小相一致。这些结果进一步支持了多基因联合体系的鉴定结果。联合P1、VPg和CP 3个基因数据集系统发育分析,可以实现PVY常见株系的准确鉴定。     

TC-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒的研究

根据已报道的菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列设计特异性引物,应用试管捕捉RT-PCR(Tube capture RT-PCR,TC-RT-PCR)技术对大豆种皮上的BPMV进行检测.结果表明,TC-RT-PCR方法能从携带BPMV的大豆种皮上扩增到预期大小的基因片段.将TC-RT-PGR扩增产物克隆测序后进行序列分析,结果显示扩增到的片段序列与BPMV的CP基因序列具有高度同源性,进一步证实了该方法的准确性.应用TC-RT-PCR方法,成功检测了一批进境大豆样品.本文建立的TC-RT-PCR方法,为大豆种子上BPMV的检测和诊断提供了一种新的参考方法.     

全基因组序列的系统发育与重组分析鉴定我国马铃薯Y病毒株系

为明确我国马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)株系组成及其在不同寄主上的分布特征,文章对31条PVY中国分离物的基因组编码区进行了系统发育及重组分析。系统发育分析结果显示,最大似然法(maximum likelihood,ML)和邻接法(neighbor-joining,NJ)重建的系统发育拓扑结构基本一致,GF_YL20、FZ10、DF、SD1、1116和9703-3等6个分离物均未与已知株系相聚,其他株系来源相同的分离物以较高的自展值相聚成簇,显示出较强的株系特异性。重组分析显示,31个PVY分离物中,共有28个PVY分离物均检测到具有显著的重组信号,这些分离物主要包括PVY~(N-Wi)、PVY~(NTN)和PVY~(NTN-NW)三种株系。进一步分析显示,分离物1104、DF、SD1、1116和9703-3为未报道过的PVY新重组分离物。株系统计结果显示PVY重组株系已上升为优势株系,生产上需要密切注意这些株系,尤其新重组分离物的发展动态。以上结果表明,综合应用PVY全基因组序列的系统发育和重组分析,可以实现PVY株系的准确鉴定。