壳聚糖锌离子固定化亲和层析填料的制备与性质

目的:制备了壳聚糖Zn2+固定化亲和层析填料,并对其性能进行了研究。方法:采用反相悬浮法制备了交联壳聚糖;再以环氧氯丙烷为活化剂,乙二胺为螯合配基,制备了固定化亲和层析填料;表征了其有效粒径以及均匀系数、含水量、失重率、氨基含量、骨架密度、堆积密度以及孔度值。从时间、加入ZnCl2的浓度、温度、pH方面对Zn2+固定化条件进行了优选,并确定了Zn2+的固定化量。含组氨酸标签的乙醛脱氢酶粗酶液,经硫酸铵盐析后,考察了壳聚糖Zn2+固定化亲和层析填料的亲和性能。结果:制备的填料有效粒径为105μm;均匀系数为1.46;含水量为58.03%;失重率为85.43%;氨基含量为9.20mmol/g;骨架密度为1.217 8g/ml;堆积密度为0.843 2g/ml;孔度值为36.40%。固定化Zn2+的最佳条件是:时间3 h、加入ZnCl2溶液浓度0.1mol/L、温度28℃、pH 5.5;且此条件下,亲和层析填料中Zn2+固定化量为3.35mmol/g。壳聚糖Zn2+固定化亲和层析填料对乙醛脱氢酶的亲和性能为4.14IU/g(干重)。结论:制备了壳聚糖Zn2+固定化亲和层析填料,可用于带有组氨酸标签重组蛋白的快速分离与纯化。     

Dextran不连续密度梯度离心法纯化大鼠胰岛

目的评价Dextran不连续密度梯度离心法纯化大鼠胰岛的效果。方法采用V型胶原酶分离出大鼠胰岛,并应用Dextran不连续密度梯度离心法纯化胰岛。在体视镜下计数双硫腙染色的胰岛并测量染色胰岛的直径。放免法测定胰岛素含量。AO-PI双染色确定胰岛的活力。结果平均每只成年Wistar大鼠的胰腺可分离950±24个胰岛,经Dextran纯化后平均每只成年Wistar大鼠的胰腺可获得784±10个胰岛,纯度可达到90%以上。结论采用Dextran不连续密度梯度纯化得到的Wistar大鼠胰岛结构完整、功能良好。     

促红细胞生成素定点突变及活性考察

促红细胞生成素(EPO)是一种多效细胞因子,具有促进红细胞生成和组织修复作用,在用于组织修复时会导致血粘度升高,改变其结构降低副作用是其应用的关键。我们对EPO进行定点突变,筛选能够降低促红细胞生成的突变体,为进一步组织修复研究提供基础。本实验中我们利用定点突变试剂盒分别将人源性促红细胞生成素中7个赖氨酸突变为谷氨酰胺;原核表达并纯化突变蛋白;所得产物腹腔注射KM小鼠体内,通过检测小鼠血中的网织红细胞指数考察mEPO(mutantEPO)的活性。rhEPO(recombinantEPO)及7个mEPO组的网织红细胞指数与阴性对照组比较,p值均小于0.05,有显著性差异;mEPO(K97Q)与rhEPO阳性对照组比较,p0.05有显著性差异,这说明原核表达的rhEPO及mEPO均具有促红细胞生成活性,mEPO(K97Q)的促红细胞生成作用明显降低,可能在组织修复过程中减少副作用的发生,为进一步多点突变奠定了基础。