阿司咪唑对宫颈癌细胞HeLa自噬的影响

该研究利用蛋白质免疫印迹法(Western blot)、稳定表达m Cherry-EGFP-LC3B(microtubuleassociated proteins 1A/1B light chain 3B,LC3)自噬双标荧光细胞、mt-Keima荧光探针活细胞扫描技术在人宫颈癌细胞He La中检测了多种自噬相关标志物,探究了阿司咪唑(astemizole,AST)对He La细胞自噬的影响。结果表明,阿司咪唑在He La细胞中引起自噬标志蛋白质LC3-II与SQSTM1/p62的显著累积,并存在剂量和时间依赖性效应;阿司咪唑导致He La细胞存活率显著降低;用自噬抑制剂Bafilomycin A1(Baf-A1)阻断自噬流(autophagic flux)后,再加入阿司咪唑不能促进LC3-II进一步累积;阿司咪唑处理细胞后自噬体与自噬溶酶体的数量均显著增加;此外,阿司咪唑显著抑制了线粒体氧化磷酸化解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone,CCCP)导致的线粒体标志蛋白质TOMM20(translocase of outer mitochondrial membrane 20)的降解,其线粒体自噬水平显著低于对照组。以上结果证明了阿司咪唑有抑制自噬流的作用,导致损伤的线粒体不能被顺利降解,并且提示该作用可能是通过抑制溶酶体功能实现的。     

构建基于Keima蛋白的细胞自噬评价体系

目的:构建表达Cyto-Keima蛋白的宫颈癌细胞系HeLa及小鼠原代神经元,作为新的细胞自噬评价体系。方法:包装pCDH-Cyto-Keima慢病毒,感染HeLa细胞和小鼠原代神经元,采用激光共聚焦荧光显微镜观察Cyto-Kei?ma蛋白在HeLa细胞和小鼠原代神经元中的表达情况,用已知自噬诱导剂和抑制剂处理细胞,检测该体系对自噬的响应。结果:感染Cyto-Keima慢病毒48 h后,通过激光共聚焦荧光显微镜观察,细胞表达Cyto-Keima蛋白;在Earle平衡盐溶液或自噬诱导剂雷帕霉素处理下,HeLa-Cyto-Keima细胞和Cyto-Keima原代神经元自噬水平明显增强;在自噬抑制剂巴弗洛霉素A1和氯喹处理下,细胞自噬水平明显降低。结论:构建了基于Cyto-Keima蛋白的细胞自噬评价体系。