优化外源基因在大肠杆菌中表达的翻译起始率的策略和方法(英文) |
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引用本文: | 王易伦,郭赢军,裘敏燕,陆长德.优化外源基因在大肠杆菌中表达的翻译起始率的策略和方法(英文)[J].生物化学与生物物理学报,1998(6). |
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作者姓名: | 王易伦 郭赢军 裘敏燕 陆长德 |
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作者单位: | 中国科学院上海生物化学研究所,第二军医大学分子遗传系 |
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摘 要: | mRNA的翻译起始区(TIR)的二级结构对翻译起始率有很大的影响。本文建立了一种改进外源基因在大肠杆菌中翻译起始率的系统。以人分裂细胞核抗原(PCNA)基因为模型,将PCNA基因5′端编码区的114bp的顺序插入质粒pTZ19R中LacZ′的5′端构成融合基因。用定点突变法在PCNA的AUG的8位插入一个Shine/Dalgarno(SD)顺序GAGGT,再以合成的带部分随机序列寡核苷酸作引物,用PCR法在SD顺序两侧,即SD上游6个碱基和SD与AUG之间7个碱基,进行随机突变,它们与结构基因5′端序列形成各种可能的翻译起始区(TIR)二级结构。重组质粒转化大肠杆菌株JM109(DE3),5′PCNA-lacZ′mRNA可通过诱导表达T7RNA聚合酶而得到专一而有效的转录。通过在X-gal板上蓝色筛选以及随后的杂交鉴定,共得到269个5′PCNA-lacZ′融合质粒。从中选择8个不同蓝色的重组子进行β-gal活性测定,结果表明它们的酶活性相差在20倍以上。而RNA点杂交表明它们在转录水平无明显的差异。由此提示,通过此策略和方法能得到一个在大肠杆菌中能高效表达的翻译起始区。
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关 键 词: | 翻译起始 5′PCNA-LacZ′融合蛋白 随机突变 |
A New Strategy for Optimizing the Translation Initiation Rate of Foreign Gene Expressed in E.coli * |
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